Optimizamos un método altamente calificado y clínicamente aplicable para la expansión de células T asesinas inducidas por citoquinas derivadas de PBMC y para la evaluación de su citotoxicidad contra los cánceres. La ventaja de esta técnica es proporcionar un procedimiento operativo estándar para que los técnicos y los médicos cuantifiquen la potencia de las células asesinas inducidas por citoquinas tanto en la investigación científica como en la evaluación clínica. Comience este procedimiento con una preparación de células CIK como se describe en el protocolo de texto, luego lave las células CIK con 10 mililitros de PBS estéril.
Centrifugar durante 10 minutos a 300 veces G y 18 a 20 grados Celsius. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con cinco mililitros de PBS. Cuente los números de celda y pruebe la viabilidad de las células utilizando el ensayo de exclusión azul de trypan.
Aliquot las células CIK en seis tubos esterilizados de 1,5 mililitros a una densidad de aproximadamente 5 a un millón de células por mililitro de PBS. Etiquete y trate las celdas como se detalla en el protocolo de texto. Mezclar suavemente las células CIK con los anticuerpos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta de esterilización de un mililitro.
Incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 300 veces G y 18 a 20 grados Centígrados. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con un mililitro de PBS, luego pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de un mililitro.
Transfiera la suspensión celular a un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros estéril con una tapa de colador celular pipeteando suavemente a través de la tapa, luego coloque los tubos en el carrusel en orden. Abra el software de análisis de citometría de flujo y cree una carpeta experimental, luego haga clic en el nuevo botón de muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento. Asigne un nombre a los tubos que aparecen en el protocolo de texto.
Para crear un sistema de medición de dispersión para las poblaciones de celdas CIK, primero seleccione el tubo uno y haga clic en el botón de trazado de puntos para crear una gráfica FSCA SSCA. Dibuje una puerta rectangular sobre toda la población de celdas con un umbral FSCA superior a 5000 para excluir los desechos celulares. Seleccione el parámetro FSCA FSCH para la nueva gráfica de puntos y dibuje una puerta poligonal alrededor de todas las celdas individuales.
Seleccione el recuento frente a CD3 conjugado por FITC y el parámetro CD56 conjugado con APC para la nueva gráfica del histograma. Seleccione el parámetro CD3 conjugado por FITC frente al parámetro CD56 conjugado por APC para la nueva gráfica de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones. Registre los datos de 20.000 células individuales en cada muestra.
Haga clic en el botón de muestra de carga para analizar primero la muestra de control en blanco. Identifique toda la población de células CIK utilizando los parámetros de canal CD56 y CD3. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de la muestra individual para analizar las poblaciones de células CIK y volver a imprimirlas en archivos de análisis.
Para realizar el ensayo citotóxico, cocultura CIK y las células de leucemia mieloide crónica humana K562 añadiendo un mililitro de células K562 a cada pozo en una placa de seis pozos a una densidad de 5 millones de células por mililitro, luego agregue un mililitro de medio basal con o sin células CIK a la placa de seis pozos como se indica en el protocolo de texto. Mezcle las suspensiones celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces. Coloque la placa en la incubadora durante 24 horas.
Ahora, cocultura CIK y células ováricas OC-3 mediante la adición de un mililitro de medio basal con o sin células CIK a la placa de seis pozos como se enumeran en el protocolo de texto. Mezcle las suspensiones celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces. Coloque la placa en la incubadora durante 24 horas.
Después de la incubación, cosecha la suspensión celular CIK K562 directamente en un tubo estéril de 15 mililitros. Para cosechar las células de suspensión y adherencia de los grupos CIK OC-3, primero transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Lavar el pozo con un mililitro de PBS esterilizado, recoger el PBS, y añadirlo al tubo, luego añadir 5 mililitros de solución enzimática de disociación celular e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius.
Añadir un mililitro de la solución desde el mismo tubo al pozo correspondiente, y mezclar suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de un mililitro. Recoger todas las células en el mismo tubo. Centrifugar a 300 veces G durante 10 minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de PBS estéril. Pelecilar las células a 300 veces G durante 10 minutos, luego aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 microlitros de PBS estéril. Agregue cinco microlitros de tinte 7-AAD a la suspensión celular.
Mezclar suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de un mililitro. Incubar durante 10 minutos y dejar en la oscuridad antes del análisis. Para realizar el ensayo de capacidad citolítica, mezcle la suspensión celular y repita la preparación para la citometría de flujo.
Haga clic en el botón de nueva muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento. Asigne un nombre a los tubos que aparecen en el protocolo de texto. Para crear un sistema de medición de dispersión para el ensayo citolítico, primero seleccione el tubo uno y haga clic en el botón de trazado de puntos para crear una gráfica FSCA SSCA.
Dibuje una puerta rectangular sobre todos los eventos con un umbral FSCA superior a 50.000 para excluir los desechos celulares. Seleccione el parámetro SSCA CFSE para la nueva gráfica de puntos y, a continuación, seleccione el parámetro CFSE 7-AAD para la nueva gráfica de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones. Haga clic en el botón de muestra de carga para analizar primero la muestra de control en blanco.
Ajuste el voltaje de SSCA y FSCA. Identifique la población de celdas muertas mediante los parámetros de canal CFSE y 7-AAD. Registre los datos de más de 20.000 células positivas CFSE en cada muestra.
Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de cada muestra individual para analizar las poblaciones de celdas no viables y exportar los datos a archivos de análisis. Los resultados representativos de la estrategia de medición para analizar la subpoblación de células T positivas CD-3 CD56 de donantes sanos se muestran con el análisis estadístico de la proporción CIK de tres individuos. La proporción positiva de células CD56 CD56 CD-3 aumentó significativamente después de 14 días de expansión.
Esto es evidente a través del 65% para el PBMC original que aumentó a 27.4%para las células CIK cosechadas el día 14. En este sistema de cultivo, las células CIK arrojaron alrededor de medio centenar de cambios de pliegue en comparación con el número original de PBMC. K562 células fueron teñidas con un tinte no fluorescente CFSE, que es cortado por esterasas intracelulares dentro de las células viables y se convierte en un tinte altamente fluorescente.
Se ilustran el tamaño y la granularidad de las células CIK y CFSE-positivas. Las células K562 manchadas por CFSE fueron copreidas con células CIK en una proporción de cero a uno, cinco a uno y 10 a una. Estas células fueron manchadas con tinte 7-AAD como sonda de viabilidad para la exclusión de células muertas.
Se evaluaron todas las células positivas 7-AAD de las células K562 positivas cfSE. Las células OC-3 manchadas por CFSE fueron co-tratadas con células CIK en una relación de 10 a uno. La citotoxicidad obvia de CIK contra las células OC-3 se demuestra aquí después de 24 horas de incubación.
CiK T-cells se ha divulgado para ejercer efectos citotóxicos significativos contra las células cancerosas y reducir los efectos adversos de la cirugía, radiación, y quimioterapia en los tratamientos contra el cáncer. La inmunoterapia es un tratamiento prometedor para una serie de cánceres. CIK se puede ampliar eficientemente in vitro mediante la incubación de PMBCs derivados del paciente en condición de grado GMP para una mayor perfusión autóloga.
Siguiendo este protocolo, podríamos ejecutar la terapia celular inmune en una instalación de grado GTP o GMP para un tratamiento clínico adicional contra el cáncer.
