Desenvolver técnicas para investigar o transporte de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma, e identificar a deslocalização das proteínas supressoras tumorais é essencial para obter uma compreensão mais profunda da patogênese da LLC e auxiliar no desenvolvimento de novas terapias. Este protocolo fornece um método rápido e eficiente para gerar frações nucleares e citoplasmáticas a partir de células CLL primárias. Essas frações podem ser usadas em experimentos a jusante, incluindo ensaios de atividade enzimática, análise proteômica e mancha ocidental.
Essa técnica ampliará nossa compreensão de como terapias e sinais microambientais dentro dos tumores alteram o fechamento de proteínas entre o núcleo e o citoplasma em células llc e potencialmente outras malignidades celulares B. Este método pode ser usado para determinar a localização de proteínas e/ou atrair o movimento proteico conforme aplicável. Realize um gradiente de detergente em cada linha celular individual que você planeja usar para garantir a geração ideal de frações nucleares e citoplasmáticas altamente enriquecidas.
Ao lado de Jodie Hay e Michael Moles, demonstrando este procedimento será Jennifer Cassels, uma técnica do meu laboratório. Obtenha amostras de sangue periférica de pacientes com leucemia linfocítica crônica previamente consentida em tubos de coleta de sangue EDTA, acompanhados pela contagem de células brancas. Amostras de sangue humano devem ser consideradas perigosas, pois potencialmente contêm vírus transmitidos pelo sangue.
Certifique-se de que essas amostras são manuseadas em um armário de biosegurança classe dois e que o usuário está usando um jaleco e luvas o tempo todo. Descarte materiais contaminados com sangue em desinfetantes. Se a contagem de células brancas for igual ou superior a 40 milhões de células por mililitro, diluir a amostra em uma proporção de um para um com tampão de lavagem DE LLC RT.
Em seguida, aliquot rt densidade gradiente médio em um tubo de centrífuga cônica de tamanho apropriado para a amostra. Coloque cuidadosamente a amostra em cima do médio e centrífuga a 400 x g durante 30 minutos no RT. Utilizando uma pipeta pasteur de plástico, colhe suavemente a camada branca de células mononucleares coletadas na interface do meio gradiente de densidade no tampão de lavagem llc. Transfira esta monocameira isolada para um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros fresco.
Para lavar as células, adicione 40 mililitros de tampão de lavagem de LLC a esta monocamada e centrífuga a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante, pisque a parte inferior do tubo para suspender a pelota e repita esta lavagem. Descarte o supernatante, pisque a parte inferior do tubo novamente e, em seguida, suspenda novamente a pelota da célula em um volume definido de tampão de lavagem de LLC, dependendo do tamanho da pelota.
Depois de contar as células e após a citometria de fluxo para verificar a pureza celular, coloque as células em placas de cultura tecidual na densidade celular necessária pronta para estimulação ou tratamento medicamentoso. Após a estimulação e/ou tratamento medicamentoso, a incubação é completa. Transfira as células para tubos de microfuça de 1,5 mililitros e pelotas individualmente rotulados por centrifugação a 200 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernascimento, suspenda a pelota celular em um mililitro de PBS gelado com inibidores de fosfatase. Centrifugar a 200 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e mantenha essas cápsulas inteiras de extrato celular no gelo para mais preparações.
Para preparar frações citoplasmáticas, suspenda suavemente as pelotas celulares em 50 microliters de 1x tampão hipertônico. Para permitir que as células inchem, incuba-as no gelo por 15 minutos. Após a realização de um gradiente de detergente para determinar a concentração ideal de detergente para usar para um tipo de célula específica, adicione 0,8 a 2,5 microliters de detergente em cada amostra e vórtice no ajuste mais alto por 10 segundos.
Para verificar a lise celular, observe as células sob um microscópio de contraste de fase antes e depois da adição de detergente. Todas as células têm um núcleo escuro e denso cercado pelo citoplasma que aparece como um halo brilhante. Uma vez lysed, centrifugar as amostras a 14.000 x g por 30 segundos a quatro graus Celsius.
Cuidadosamente, sem perturbar a pelota, transfira o supernatante para um tubo de microfuge presfriado e armazene esta fração citoplasmática a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada. Certifique-se da remoção completa da fração citoplasmática para evitar a contaminação da fração nuclear. À pelota restante, que contém a fração nuclear, adicione 50 microliters de tampão de lise completa e suspenda-se por tubulação para cima e para baixo.
Para solubilizar proteínas associadas à membrana nuclear, adicione 2,5 microliters de detergente, vórtice no ajuste mais alto por 10 segundos e incubar no gelo por 30 minutos. Vórtice na configuração mais alta por 30 segundos e centrífuga. Em seguida, transfira o supernascer para um tubo de microfuge pré-refrigerado e armazene esta fração nuclear a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada.
Para as células inteiras, suspenda-se as pelotas de extrato celular inteira em 100 microliters de tampão de lise completa por tubulação para cima e para baixo. Para garantir a lise celular completa, adicione cinco microliters de detergente e incubar no gelo por 30 minutos. Vórtice na configuração mais alta por 30 segundos e, em seguida, centrífuga a 14.000 x g por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Transfira o supernante para um tubo de microfuge pré-refrigerado e armazene toda essa célula a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada. Para quantificar o tráfico de proteínas entre frações nucleares e citoplasmáticas, realize a análise quantitativa das manchas ocidentais e importe as imagens. Para exibir a imagem na fita Imagem, clique no botão Escolher no grupo Exibir e clique no Canal Chemi.
A caixa de diálogo Escolha exibir será aberta para permitir ajustes adicionais, se necessário. Implementar melhorias adicionais usando os controles deslizantes ajustáveis na guia LUT da imagem, incluindo brilho ou contraste. Use a guia Curvas para ajustes mais finos.
Para análise de dados, clique primeiro na fita Análise. Para analisar apenas um canal, desmarque os canais que não estão sendo analisados clicando na miniatura do Canal Não-Show do canal, deixando apenas o canal desejado exibido. Para quantificar a intensidade do sinal, clique em Adicionar retângulo para adicionar retângulos à imagem.
Clique no centro de um recurso como uma banda de proteínas para colocar um retângulo ao seu redor. Depois de adicionar as formas desejadas, clique em Selecionar para retornar o cursor à ferramenta de seleção. Para subtrair o ruído de fundo, clique no primeiro botão do grupo Fundo e selecione Mediana no menu suspenso.
Defina a largura da borda para três na caixa de diálogo Fundo e selecione os segmentos que melhor representam o fundo de imagem a ser usado para o cálculo de fundo. Para exportar os dados, clique na guia Formas acima da tabela. Para a densitometria, são necessários valores na coluna Sinal.
Sinal é a soma dos valores de intensidade do pixel ou total para uma forma menos o produto do fundo na área. Em seguida, clique no botão Relatar, clique em Salvar Como ou Iniciar planilha. Para calcular a expressão normalizada da proteína de interesse para cada plano ou variável dentro da planilha salva, divida o sinal obtido para a proteína de interesse pelo sinal para a faixa de controle de carregamento de proteína correspondente.
Para exportar a imagem, clique na guia Imagens encontrada acima da tabela e clique na imagem a ser exportada. Se estiver usando a imagem para uma apresentação de slides ou outros formatos digitais, clique no ícone do software, passe o mouse sobre Exportação, clique em Imagem para Mídia Digital e, em seguida, salve a imagem conforme necessário. O enriquecimento de células LLC com um WCC superior a 40 milhões por mililitro usando centrifugação de densidade permite uma alta recuperação celular.
A análise da amostra por citometria de fluxo após a gating em FSC e SSC revelam que a pureza das células llc são mais de 95% como indicado pela expressão de superfície dupla dos marcadores celulares CLL, CD19 e CD5. Quando as manchas imuno-imuno foram realizadas nas frações resultantes da linha celular CLL, Mac-1, e células CLL primárias, o fracionamento indicou que o nível ideal de detergente para células Mac-1 estava em uma a 60 diluição, em comparação com uma a 30 para células CLL primárias. Quando a localização subcelular de FOXO1 em frações nucleares e citoplasmáticas foi determinada em células Mac-1 e CLL primárias, a geração de frações altamente enriquecidas foi mostrada pela expressão quase exclusiva de lamin no nuclear e beta Tubulin nas frações citoplasmáticas.
A expressão FOXO1 foi reduzida no citoplasma após o tratamento com AZD 8055, em comparação com ndc, acompanhada por um aumento da expressão FOXO1 no compartimento nuclear, demonstrando assim translocação proteica. Depois que manchas de imuno individuais de cinco amostras primárias de LLC foram quantificadas dentro de frações subcelulares, verificou-se que o AZD 8055 reduziu os níveis de expressão FOXO1 no citoplasma e aumentará a expressão no núcleo. BcR inter-vinculando aumento da expressão FOXO1 citoplasmática.
Lembre-se de manter todos os reagentes e amostras no gelo para evitar a degradação da proteína. As frações subcelulares geradas neste procedimento também podem ser usadas em ensaios de atividade enzimático, como um ensaio de atividade FOXO, que permite que paralelos sejam traçados entre a localização celular do FOXO1 e sua atividade de ligação de DNA. O desenvolvimento desta técnica nos permitiu abordar o tráfico de proteínas específicas dentro das células llc em resposta aos inibidores seletivos e apoia nossos estudos paralelos de imunofluorescência para gerar um conjunto de dados robusto e quantificável.
