Este protocolo é significativo, porque fornece um método para separar quatro compartimentos celulares um do outro, o citoplasma, o núcleo, as mitocôndrias e a membrana. Não só isso, mas é um procedimento escalável e reprodutível que tem resultados confiáveis. A grande vantagem desta técnica é a separação de quatro compartimentos celulares com o uso mínimo de detergentes, o que permite um procedimento de fracionamento muito mais reprodutível e confiável.
Para o isolamento de proteínas citosólicas, cultive células U937 em RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10% a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para um total final de seis por 10 até a oitava célula. Centrifugar a cultura e ressuspender o pellet celular em PBS à temperatura ambiente para uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro, pipetando suavemente para quebrar aglomerados. Após uma segunda centrifugação, ressuscite o pellet em tampão de lise gelado A a uma concentração final de dois por 10 para a sétima célula por mililitro.
Adicione 7,5 mililitros de células a um tubo cônico no gelo para extração de proteína nuclear a jusante e elimine as células restantes por centrifugação. Ressuspeite o pellet em tampão de isolamento citoplasmático a uma concentração final de dois por 10 até a sétima célula por mililitro, pipetando suavemente para quebrar aglomerados, antes de incubar as células por 20 minutos a quatro graus Celsius com rotação de ponta a ponta. No final da incubação, centrifugar a suspensão celular e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo.
Centrifugar o sobrenadante para sedimentar os detritos celulares. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga e repita a sequência de centrifugação até que nenhuma pelota possa ser observada. Quando a amostra estiver livre de detritos, armazene o sobrenadante contendo fração citosólica por até um mês a quatro graus Celsius.
Em seguida, ressuspenda o pellet celular armazenado no tampão de lise A para uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro. Para homogeneização celular, centrifugar a suspensão celular e descartar o sobrenadante para remover o excesso de digitonina e contaminantes sistólicos. Ressuspeite o pellet em tampão de homogeneização de células geladas a uma concentração final de quatro por 10 para a sexta célula por mililitro para uma incubação de 30 minutos no gelo.
Enquanto isso, para lise mecânica à base de contas, adicione 30 gramas de contas de aço inoxidável pré-lavadas de 3,2 milímetros a 15 mililitros de tampão de lise B em um tubo de contorno de 50 mililitros no gelo para esfriar. No final da incubação, substitua o tampão no tubo de rodapé por suspensão celular e misture as células por cinco minutos na velocidade oito. Após a lise, transfira o homogeneizado para um tubo limpo.
Centrifugar o homogeneizado e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Para remover quaisquer detritos remanescentes da amostra, centrifugar o homogeneizado três vezes conforme indicado, transferindo o sobrenadante para um novo tubo após cada centrifugação. Após a última centrifugação, para isolar a fração mitocondrial bruta, transfira o sobrenadante para um novo tubo para centrifugação.
Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo e coloque o pellet contendo fração mitocondrial bruta no gelo. Para isolar a fração de membrana, centrifugar o sobrenadante coletado e, após descartá-lo, colocar o pellet contendo fração de membrana bruta no gelo. Para purificação do gradiente de densidade isopícnica, ressuscite os pellets brutos mitocondriais e de fração de membrana em 200 microlitros de tampão de lise B e 1,8 mililitros de iodixanol.
Para criar um gradiente de iodixanol descontínuo para cada amostra, primeiro, adicione um mililitro de iodixanol a 15% ao fundo de um tubo ultracentrífugo de oito mililitros de parede fina de topo aberto por amostra. Em seguida, subjaz sequencialmente a um mililitro de 20% iodixanol, um mililitro de 25% iodixanol, um mililitro de 30% iodixanol e um mililitro de 35% iodixanol abaixo da camada de 15% iodixanol em cada tubo. Adicione dois mililitros da suspensão bruta de pellets mitocondriais sob a camada inferior de um gradiente e dois mililitros da suspensão de pellets de membrana bruta sob a camada inferior do segundo gradiente.
Colocar cuidadosamente um mililitro de iodixanol a 10% no topo de cada gradiente e equilibrar os tubos dentro de 10 microgramas um do outro pela adição de 10% de iodixanol, conforme necessário, antes de purificar as frações mitocondrial e de membrana por centrifugação por gradiente de densidade. No final da separação, use uma agulha para perfurar o lado dos tubos de paredes finas para coletar as bandas visíveis de cada amostra. Para o isolamento de proteínas nucleares, centrifugar a alíquota de 7,5 mililitros de células suspensas em tampão de lise A e ressuspender o pellet em 800 microlitros de tampão de solubilização de células geladas com pipetagem e vórtice.
Incube a suspensão no gelo por 30 minutos para romper as membranas plasmáticas e organelas, protegendo as proteínas nucleares. No final da incubação, centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet pipetando suavemente em 800 microlitros de tampão de lise nuclear gelado suplementado com uma unidade por microlitro de Benzonase. Incubar a mistura em um rotador de extremidade sobre extremidade a quatro graus Celsius para romper a membrana nuclear.
Após 30 minutos, sonicate a mistura três vezes por cinco segundos a 20% de potência com uma pausa de cinco segundos entre os pulsos para cisalhar os ácidos nucleicos. Após a última sonicação, centrifugar o homogeneizado e coletar o sobrenadante como a fração nuclear sem perturbar o pellet. O western blot de cada uma das frações após a purificação do gradiente de densidade mostra a localização da fração mitocondrial para as camadas de 25 e 30% de iodixanol e a localização da fração de membrana para as camadas de 10 e 15% de iodixanol.
A análise ocidental do sangue também confirma que cada amostra isolada é pura e livre de contaminação por proteínas de outras partes da célula. Além disso, a análise densitométrica da intensidade da banda de cada amostra confirma a reprodutibilidade e a significância estatística dos dados. A execução inadequada do fracionamento pode resultar em contaminação cruzada dos componentes celulares.
Uma alta concentração de histona H3 na fração citosólica, por exemplo, pode ser devida ao esclarecimento inadequado da fração citosólica. A falha durante a purificação da densidade isopicnica pode resultar em contaminação da fração de membrana. Pode ser útil realizar um ensaio de quantificação de proteínas antes da análise de sangue ocidental para confirmar que as frações realmente contêm proteína para permitir o carregamento de gel com base na quantidade de proteína e para confirmar que o procedimento foi executado corretamente.
É fundamental que a fração citoplasmática não contenha um pellet. Western blots, ou ELISAs podem ser realizados seguindo este procedimento para permitir que você analise a localização subcelular de diferentes proteínas sob certas condições. Essa técnica permitiu analisar o tráfico de diferentes fatores de morte celular em condições de hiperglicemia.
E assim, para nós, isso ajudou a lançar luz sobre o mecanismo da mudança hiperglicêmica da apoptose para a necrose.
