o bioink pdECM pode fornecer um microambiente benéfico para ilhotas pancreáticas usando componentes e arquitetura específicos do tecido e tem propriedades neurológicas ideais que reduzem as mortes celulares e aumentam sua impressão. A principal vantagem dessa técnica é que a composição específica do tecido pode ser preservada dentro do bioink pdECM promovendo um crosstalk construtivo entre construções de tecido pancreático 3D e ilhotas encapsuladas. O desenvolvimento do encapsulamento de ilhotas no bioink pdECM pode ser aplicado à fabricação de construções transplantáveis de tecido pancreático para o tratamento de diabetes tipo um.
Este bioink pode ser usado para ampliar a aplicação de construtos transplantáveis, bem como modelos de tecido in vitro para diabetes, complicações relacionadas ao diabetes e câncer de pâncreas. Para a descelularização de uma amostra de tecido de pâncreas suíno congelado, use um ralador para cortar o pâncreas congelado em pedaços de um milímetro de espessura e transfira 50 gramas do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mililitros. Lave o tecido com 300 mililitros de água destilada a quatro graus Celsius em um agitador orbital digital a 150 rotações por minuto por aproximadamente 12 horas.
Quando a água turva desaparecer, substitua a água por 400 mililitros de 1%Triton-X 100 na PBS por 84 horas. No final do tratamento do detergente, incubar o tecido com 400 mililitros de isopropanol por duas horas para remover a gordura restante do pâncreas, seguido por uma lavagem de 24 horas em 400 mililitros de PBS. No final da lavagem, esterilize o tecido descelularizado com 400 mililitros de ácido peracético de 0,1% em 4% de etanol por duas horas antes de lavar a amostra com 400 mililitros de PBS fresco por seis horas para remover qualquer detergente residual.
No final da lavagem, use fórceps para transferir os pedaços de tecido em um tubo cônico de 50 mililitros e recongelar a amostra a menos 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, cubra o tubo cônico com um lenço sem fiapos fixado com um elástico e liofilize o tecido descelularizado a menos 50 graus Celsius por quatro dias. Para preparar o bioink, transfira 200 miligramas de pdECM seco congelado para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 20 miligramas de pepsina e 8,4 mililitros de ácido acético molar de 0,5 para a amostra de tecido.
Em seguida, coloque uma barra de agitação magnética no tubo para uma incubação de 96 horas de agitação a 300 rotações por minuto. No final da incubação, use um coador de células de 40 micrômetros e uma pipeta de deslocamento positiva para filtrar a solução em um novo tubo no gelo para filtrar quaisquer partículas não digeridas e adicionar um mililitro de 10X PBS ao tubo. Após o vórtice, use hidróxido de sódio para ajustar o pH da solução para sete.
Para preparar o bioink para a impressão de células 3D de uma construção pancreática com uma estrutura padronizada, colora uma alíquota de bioink pdECM com 0,4%Trypan Blue e uma alíquota com Rose Bengal Solution em uma proporção de um a 20. Em seguida, use uma pipeta de deslocamento positiva para misturar suavemente cada solução de bioink com uma solução de ilhota suspensa média em uma proporção de três para um para uma concentração final de 1,5% bioink e uma densidade celular de três vezes 10 para o equivalente de três ilhotas por mililitro. Para a impressão celular 3D de construções de tecido pancreático de base multimaterial, carregue cada mistura de ilhotas de bioink em seringas esterilizadas individuais equipadas com bicos de 25 bitolas e imprimam 3D cada bioink em condições otimizadas de impressão a 18 graus Celsius na forma de uma rede com linhas alternadas de azul e vermelho.
Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa em uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, mergulhe a construção impressa em RPMI 1640 médio suplementado com soro bovino 10% fetal e 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina. Após o processo de descelularização, 97,3% do DNA de dupla garuda é removido e os componentes da matriz extracelular representativa, como colágeno e glicosaminoglicanos permanecem em 1278,1% e 96,9% em comparação com o tecido pancreático nativo, respectivamente.
Nesta análise representativa, o bioink pdECM apresentou um comportamento de afinamento de tesoura com um valor de aproximadamente 10 pascals por segundo na taxa de tesoura de um por segundo indicando que o bioink demonstrou as características reológicas apropriadas para extrusão através de um bocal. Além disso, o módulo complexo do bioink começou a aumentar quando a temperatura atingiu 15 graus Celsius e rapidamente aumentou quando a temperatura foi mantida a 37 graus Celsius indicando a transição sol-gel da solução. O dinâmico G prime e G duplo prime do bioink pdECM foram investigados a temperaturas fisiologicamente relevantes para garantir sua estabilidade após o processo de impressão resultando na obtenção de um módulo estável sob a condição de varredura de frequência.
Usando um sistema de impressão multifacetado, vários tipos de construções 3D poderiam então ser fabricados como demonstrado usando o pdECM desenvolvido demonstrando a versatilidade do pdECM com o propósito de bioimpressão 3D para harmonizar dois ou mais tipos de tecidos vivos em um arranjo semelhante a tecido. Seja gentil ao misturar o bioink com as células para evitar a morte celular e a formação de bolhas, pois a presença de bolhas reduz a resolução de impressão e reduz a viabilidade celular. A funcionalidade das ilhotas pancreáticas encapsuladas dentro das construções de tecido pancreático 3D pode ser avaliada por coloração de imunofluorescência ou um teste de tolerância à glicose.
Esta técnica de bioink pdECM e bioimpressora 3D pode potencialmente ser usada para o desenvolvimento de construções funcionais de tecido pancreático no campo da engenharia de tecidos. Os pesquisadores devem usar os equipamentos de proteção individual adequados para evitar lesões ao manusear o ralador afiado e os reagentes.
