Este protocolo nos permite investigar stents que elugem de drogas em um pequeno modelo animal de estenose laringotraqueal, permitindo-nos aproveitar animais geneticamente modificados de forma econômica. A colocação transoral do stent das vias aéreas que eluia de drogas poupa os animais de uma incisão aberta na traqueia representando um modelo mais clinicamente relevante de estenose laringotraqueal. Esta técnica facilita a investigação pré-clínica das estratégias locais de entrega de medicamentos para tratar a estenose laringotraqueal.
Esta técnica fornece uma plataforma viável e eficaz para a investigação translacional de stents de vias aéreas que eluem drogas em um pequeno modelo animal que pode ser aplicado para investigação futura em modelos animais maiores, bem como aplicação clínica. técnica particularmente a intubação transoral, indução de lesão traqueia, e a etapa de colocação do stent das vias aéreas. A demonstração visual desta cirurgia tecnicamente desafiadora é crítica, pois muitos dos detalhes finos não podem ser totalmente descritos em palavras.
Para fazer uma solução de 1%rapamicina contendo polímero, adicione seis miligramas de rapamicina a 600 miligramas de 70-30 PLLA-PCL em um frasco de vidro. Sob um capô de fumaça, adicione seis mililitros de diclorometano ao frasco de rapamicina suplementado e controle e adicione 120 microliters de glicerol a cada frasco. Em seguida, tampe os frascos e deixe a solução PLLA-PCL homogeneizar por seis a 12 horas em temperatura ambiente.
Para criar um stent das vias aéreas murinas, utilizando materiais estéreis e técnica, aplique um mililitro de solução PLLA-PCL suplementada de rapamicina na cânula venosa de um angiocateter à base de etileno fluorado de 22 bitolas enquanto retarda a rotação do cateter. Quando toda a solução tiver sido aplicada, apoie o angiocateter moldado com a ponta do angiocateter voltado para baixo e o punho do cateter na borda de uma placa de vidro Petri em uma capa de vácuo. Após 24 horas sob vácuo à temperatura ambiente, torça suavemente e deslize o cateter a partir da construção do stent seco e verifique circunferencialmente o stent quanto a quaisquer defeitos que possam ter resultado durante o processo de fundição.
Para ajudar na visualização, é útil desenhar uma linha preta fina pelo comprimento do stent. Corte cada extremidade dos stents fundidos com uma tesoura reta fina para que as bordas sejam axiais e use a tesoura para cortar cada stent em segmentos axial de três milímetros. Em seguida, carregue cada stent de três milímetros em um novo cateter venoso calibre 22.
Para indução de estenose laringotraqueal, depois de confirmar a falta de resposta ao dedo do pé, coloque o primeiro mouse em uma plataforma cirúrgica na posição supina e dê um loop de um pequeno pedaço de rosca afixado no topo da plataforma em torno dos incisivos centrais. Fixar os membros na mesa com fita adesiva e fazer uma incisão vertical de 1,5 centímetros no pescoço do mouse. Divida o timo sobrelado e lateralize os dois lóbulos resultantes para visualizar a traqueia.
Divida os músculos esternonióides e esternotireóides no apego superior bilateralmente e passe um angiocateter de 22 bitola transorly através da laringe na traqueia. Utilizando pequenas fórceps, aplique pressão na laringe anterior do mouse para auxiliar na colocação correta do cateter. Um angiocateter corretamente colocado pode ser visualizado por sua cor branca através da traqueia.
Para induzir a lesão, passe uma escova de arame revestida de Bleomycin através do angiocateter inserido e retire lentamente o cateter para que apenas a escova de arame permaneça dentro da traqueia. Usando fórceps finos, aplique contrapressão na traqueia para interromper mecanicamente o lúmen traqueal com a escova antes de reinserir o cateter na traqueia sobre a escova. Remova a escova de arame e reaplique a Bleomycin antes de inserir e remover a escova mais quatro vezes, como apenas demonstrado.
Após a última aplicação de Bleomimicina, remova o cateter da traqueia. Para a colocação transoral de um PLLA-PCL, certifique-se de que uma linha vertical preta fina tenha sido incorporada em cada stent e entubar transorally o mouse com o angiocateter pré-carregado. O stent deve ser visualizado dentro da traqueia através da incisão transcervical.
Quando o stent estiver no lugar, use fórceps finos para segurar firmemente, mas suavemente a traqueia através da incisão para manter o stent no lugar e remover o cateter. É fundamental colocar o stent o mais cuidadosamente possível. Muita pressão sobre a traqueia resultará no colapso do stent causando obstrução das vias aéreas e morte ao animal.
Feche a incisão com cola tecidual ou suturas cromicas absorvíveis 4-0 usadas aqui e permita que o rato se recupere com monitoramento antes de devolver o animal à gaiola de origem. No ponto final experimental apropriado, coloque o mouse de interesse na posição supina na plataforma cirúrgica e use uma tesoura de íris curva fina para reabrir a incisão. Exponha a traqueia como demonstrado e use a tesoura para dividir a traqueia distal abaixo do nível do stent.
Em seguida, divida a traqueia proximal abaixo da laringe e acima do stent e separe a traqueia dividida do esôfago posteriormente. Em seguida, remova o stent da traqueia e fixe a traqueia em 10% de formalina por 24 horas. A construção de stent PLLA-PCL carregado biodegradável utilizada neste estudo é capaz de eluir a rapamicina de forma consistente e previsível em condições fisiológicas.
Nesta imagem, o stent biocompatível miniaturizado pode ser observado in situ dentro da traqueia, conforme indicado pelo marcador preto no stent visualizado através da traqueia translúcida do rato. Após 21 dias, o marcador de corante preto pode ser usado para confirmar a manutenção da posição do stent dentro da traqueia. Testes de biocompatibilidade utilizando coloração imunofluorescente para marcadores de inflamação aguda e crônica demonstram que o edifício de stent PLLA-PCL não é imunoreactive, conforme determinado pelo número mínimo de células imunes presentes após a colocação na ausência de lesão.
Manipular as vias aéreas de forma delicada e atraumática é fundamental para o sucesso do procedimento. Força excessiva, múltiplas intubações e colapso do stent podem levar à morte de animais. Após o tratamento com stent de eluição de rapamicina, avaliação da sobrevivência, expressão genética via PCR quantitativo em tempo real, imunoensatórios incluindo citometria de fluxo, ELISA e imunohistoquímica podem ser realizados.
Como fornece uma plataforma de sucesso para a elução de medicamentos em um modelo de camundongo, esta técnica abre caminho para futuras investigações de terapêuticas aplicadas localmente em estenose laringotraqueal. Diclorometano é um líquido corrosivo. Certifique-se de sempre usar um capô de fumaça, equipamentos de proteção individual e materiais não corrosivos
