Um desafio no campo da biologia adiposa tem sido manter o adipócito maduro na cultura. Desenvolvemos um novo método que permite o estudo do adipócito a longo prazo ao longo de grandes mudanças. Nossa técnica de cultura adipócito permite o estudo das interações celulares e, esperançosamente, será útil para o desenvolvimento de novos tratamentos para diabetes e obesidade.
É importante seguir o protocolo com cuidado, pois existem algumas etapas críticas que impactam muito a qualidade genética e a viabilidade dos adipócitos maduros. Por exemplo, antes de chapeamento certifique-se de que todo o lipídio livre e tampão de lavagem tenha sido removido caso contrário, os lipócitos poderiam rasgar quando as pastilhas são invertidas. Depois de receber a amostra de tecido adiposo subcutâneo humano, coloque o tecido em um armário de segurança biológica estéril em uma placa de Petri de 15 centímetros.
Um pequeno volume de média 199 para o prato. Use pinças para agarrar grandes vasos fibrosos dentro do tecido e use a parte de trás da ponta de uma tesoura fechada para raspar suavemente o adiposo ao longo do vaso para liberar os adipócitos. Quando todas as células foram coletadas, descarte os grandes pedaços de tecido fibroso e pese a gordura aparada.
Para liberar ainda mais as células do tecido adiposo, transfira 10 gramas de tecido adiposo para uma nova placa de Petri de 15 centímetros e use uma tesoura curva para cortar cuidadosamente a gordura até que se torne uma mistura homogênea lisa sem grandes pedaços de adiposo. Quando toda a gordura for processada, use uma colher para transferir 10 mililitros de tecido picado em tubos individuais de 50 mililitros e adicione 30 mililitros de tampão de digestão a cada tubo. Em seguida, coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e 150 rotações por minuto durante 30 a 35 minutos.
A digestão é completa quando a solução adiposa é homogênea, colorida de damasco e ausente de peças grandes. No final da digestão, decante a solução de gordura digerida em um filtro de malha de 250 micrômetros dentro de um funil colocado em um frasco de um litro estéril. Quando todo o volume de suspensão adipócito tiver sido iludido, aperte suavemente o filtro de malha para aumentar o rendimento dos adipócitos e lave o filtro com 50 a 100 mililitros de tampão de lavagem antes de apertar novamente o filtro.
Transfira a solução isolada de adipócito para um funil de separação e adicione o tampão de lavagem até que o funil esteja quase completamente preenchido. Inverter suavemente o funil algumas vezes para misturar a suspensão adipócito com o tampão e deixar a suspensão ficar por dois a três minutos até que haja uma separação distinta das camadas. Quando as camadas se separarem, abra o bocal no funil e iludia lentamente a solução inferior em um frasco estéril.
Quando toda a colagem foi removida, colete a solução de adipócito maduro purificada em tubos cônicos de 50 mililitros e levemente embalar as células por centrifugação. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para remover o tampão de lavagem restante abaixo da suspensão do adipócito e use uma pipeta para remover a camada lipídica livre flutuando acima dos adipócitos maduros. Para a semeadura dos adipócitos maduros, coloque o componente de inserção de membrana permeável de cabeça para baixo em uma superfície estéril e inverta suavemente os tubos de adipócitos embalados algumas vezes para garantir uma distribuição uniforme das células.
Usando uma ponta de pipeta larga, adicione 30 microliters de adipócitos maduros embalados em cada membrana. Inverter o painel de inserção em um movimento suave para que os adipócitos semeados estejam na parte inferior das pastilhas. Coloque o painel de inserções em uma placa de 24 poços contendo 500 a 1.000 microliters de meio completo de 37 graus Celsius por poço.
Em seguida, cubra a placa e coloque cuidadosamente a placa em uma incubadora de cultura de tecido. A cada sete dias de cultura, substitua o meio através do orifício de recorte em cada inserção. Após uma semana de cultura, agregados de adipócito maduros isolados do tecido adiposo subcutâneo mantêm a morfologia de gotícula lipídica unilocular característica observada apenas em adipócitos maduros.
O tratamento com os agonistas PPAR-GAMMA pioglitazone e rosiglitazone resulta em uma expressão aumentada nos genes responsivos PPAR-GAMMA, enquanto o tratamento com o receptor glicocorticoide agonista dexametasona não tem efeito sobre esses genes. Da mesma forma, o agonista do receptor glicocorticoide impulsiona robustamente a expressão genética dos genes-alvo do receptor glicocorticoide, enquanto os agonistas PPAR-GAMMA não têm efeitos significativos sobre esses genes. Além disso, o tratamento de sete dias com os agonistas PPAR-GAMMA induz robustamente a expressão genética do gene específico da gordura marrom, UCP1.
Nosso novo modelo in vitro adipócito pode ser usado para os estudos funcionais em adipócitos maduros, incluindo absorção de glicose, lipogênese e lipólise. Com esta nova técnica de cultura adipócito, pudemos mostrar que adipócitos brancos maduros humanos podem transdiferenciar em adipócitos marrons.
