Este protocolo facilita o isolamento e a cultura reprodutível de longo prazo dos hepatócitos de camundongos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D para estudar a formação de estrutura canônica e sua resposta ao tratamento in vitro. Uma vez que a técnica tenha sido dominada, é um método rápido para obter grandes volumes de população de hepatócitos de camundongos altamente viáveis e puros para estudos in vitro. Demonstrando o procedimento estará Lenka Sarnova, técnica do nosso laboratório.
Um dia antes do isolamento primário do hepatocito, adicione 100 microliters de 10X DMEM, 485 microliters de água destilada e 15 microlitres de um hidróxido de sódio molar em 500 microliters ao colágeno de cauda-rato. Verifique o pH do colágeno neutralizado. Deve ser cerca de 7.5.
Usando uma dica de pipeta de 200 microliteres pré-resfriada, espalhe 100 microliters da solução de colágeno neutralizado sobre cada um dos pratos plásticos de cultura de 3,5 centímetros de diâmetro no gelo e coloque os pratos em condições de cultura padrão durante a noite. Na manhã seguinte, reidratar as camadas de colágeno com um mililitro de 37 graus Celsius PBS por prato por pelo menos três horas a 37 graus Celsius. Para isolar o fígado, depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque o rato anestesiado em um tapete de dissecção na posição supina e tape as extremidades inferior e superior ao tapete.
Co swab o abdômen com 70% de etanol e faça uma incisão em forma de V da área púbica para cada membro dianteiro. Dobre a pele sobre o peito para descobrir a cavidade abdominal e coloque o tapete sob um microscópio dissecando. Mova o intestino delgado e o cólon na direção caudal para expor o IVC e carregue uma seringa de dois mililitros com 2,5 mililitros de solução Celsius de 37 graus C.Conecte a seringa à cânula e use um s swab de algodão encharcado PBS para pressionar o fígado até o diafragma.
Coloque uma sutura encharcada ao redor do IVC logo abaixo do fígado. Em seguida, usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 30 dobrada para um ângulo de 45 graus, injete 10 microliters de 5.000 unidades por mililitro de heparina na veia portal. Para canonizar o fígado, use uma tesoura microcirúrgica para fazer uma pequena incisão no IVC diretamente ao lado do fígado e inserir a cânula na incisão.
Fixar a cânula no lugar com suturas e dois nós cirúrgicos e cortar a veia portal para permitir que os tampões de perfusão fluam do fígado. Em seguida, deprime lentamente o êmbolo da seringa para perfundir o fígado com dois mililitros da solução durante um período de cerca de 15 segundos. Quando toda a solução tiver sido entregue, preencha uma bomba peristáltica com solução C fresca de 37 graus Celsius e verifique o aparelho de perfusão para garantir que não haja bolhas de ar no sistema.
Desconecte cuidadosamente a cânula da seringa e conecte cuidadosamente o tubo da bomba peristáltica em funcionamento à cânula. Inicie imediatamente a perfusão a uma taxa de fluxo de 2,5 mililitros por minuto. Após dois minutos, mude para a solução D e continue a perfusão por mais 10 minutos.
No final da perfusão, colhe cuidadosamente o fígado em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de solução Celsius de 37 graus E.To isolar os hepatócitos primários, segurando o fígado pela cânula, esfregar o tecido ao redor da parede do tubo para derrubar os heptocitos no tampão. Quando todo o tecido for purê, transfira o chorume de tecido para um coador de nylon poros de 70 micrômetros para filtrar as células isoladas em um novo tubo de 50 mililitros. Sedimentar as células hepáticas por centrifugação e resuspensar a pelota em 20 mililitros de 40% percoll em DMEM.
Separe as células vivas e mortas por centrifugação e resuspengue a pelota em 20 mililitros de solução E.Depois de centrifugar as células novamente, resuspensar a pelota em 10 mililitros de solução fresca E para contar. Após a contagem, ajuste a contagem primária de hepatócitos para 3,75 vezes 10 para as cinco células viáveis por mililitro do meio de cultura hepatócica. Para cultivar os hepatócitos primários isolados em sanduíches de colágeno 3D, use uma pipeta de um mililitro para distribuir uniformemente dois mililitros de células em cada prato revestido de colágeno de 3,5 centímetros de diâmetro.
Coloque as células na incubadora de cultura celular por três horas. Durante a incubação, prepare 100 microliters de colágeno de cauda de rato neutralizado uma solução por prato como demonstrado. No final da incubação, substitua cuidadosamente as células médias e não-endectadas por 100 microliters de colágeno neutralizado por prato e devolva as placas à incubadora de cultura celular por uma hora.
Quando o colágeno se solidificar, adicione cuidadosamente dois mililitros de cultura hepatócida fresca em cada prato e devolva as culturas à incubadora por três a oito dias verificando as culturas diariamente sob o microscópio. Para a imunolabelação dos hepatócitos primários dentro dos sanduíches de colágeno 3D, lave cada sanduíche cuidadosamente com 37 graus Celsius PBS e fixe as culturas com um mililitro de 4% de paraformaldeído em PBS por prato por 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da fixação, lave os pratos três vezes por 10 minutos em dois mililitros de PBS suplementados com 0,1%Tween 20 por lavagem.
Após a última lavagem, permeabilize as células com um mililitro de 0,1 molar de glycina e 0,2%Triton X-100 em PBS por uma hora à temperatura ambiente seguido por três lavagens em PBS mais Tween 20 como apenas demonstrado. Em seguida, use uma ponta de carga de 10 microliter conectada a um vácuo para perturbar suavemente a camada superior do colágeno e bloquear qualquer ligação inespecífica com um mililitro de 5% de colagem de soro bovino em PBS Tween por duas horas. No final da incubação, adicione os anticorpos primários de interesse diluídos em solução de bloqueio para cada prato e incubar durante a noite a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, lave os pratos com três lavagens de 15 minutos em PBS Tween seguidas de rotulagem com os anticorpos secundários apropriados a 37 graus Celsius por cinco horas. No final da incubação, lave as culturas duas vezes com PBS Tween e uma vez com água destilada como demonstrado antes de montar o prato com meio de montagem anti-fade para microscopia. Um dia após a semeadura em sanduíches de colágeno 3D, os hepatócitos primários do rato formaram aglomerados e auto-organizados em uma rede aproximadamente regular de canaliculi bile.
Dentro de três a seis dias, aglomerados de cinco a dez células são geralmente observados com hepatócitos totalmente polarizados formando uma rede canalicular. O tratamento com drogas que alteram o citoesqueleto ou citoesqueleto resulta em alterações no citoesqueleto hepatocitte e na largura, forma e número do canaliculi de biliócicas. Embora o tratamento do etanol apresente apenas um efeito leve na organização da queratina 8, aumenta a tortuosidade e distribuição das larguras canalizais biliais.
A intensidade do sinal da coloração do ZO-1 é diminuída no canaliculi biliaz tratado com etanol em comparação com controles não tratados que sugerem perda de junções do tipo após o tratamento do etanol. A inibição da contratude da actomyosina com Blebbistatin induz a formação de canaliculi biliculi de forma desordenada, grossa e arredondada. Além disso, o tratamento com ácido okádico inibe fosfattases que afetam fortemente as propriedades físicas das queratinas e resultam em canaliculi bile que são significativamente estreitados em comparação com controles não tratados.
Além disso, o tratamento do etanol eleva significativamente os níveis de alanina e aspartato amino transferases sugerindo lesões hepatocelulares graves, enquanto o tratamento blebbistatin não leva a nenhuma consideração de mudanças nos níveis transaminase e o tratamento de ácido okadaico desencadeia alterações bioquímicas leves na aminotransferase alanina, mas nenhuma mudança na expressão aminotransferase aspartate. É importante continuar trabalhando relativamente rapidamente durante a cannulação e no início da perfusão e evitar que bolhas entrem no sistema de perfusão. Os lises celulares podem ser coletados em poços duplicados para proteínas de interesse para determinar se mudanças na expressão proteica e/ou estágios de ativação ocorrem durante o tratamento.
