O protocolo fornece um método de cultura celular primária fácil de manusear e amplamente compatível para invertebrados marinhos. Essa técnica dá aos pesquisadores uma maneira de cultivar as células invertebrados marinhas por comparativamente longo tempo. Uma cultura de células deve ser fornecida com formação genética consistente para diferentes aplicações experimentais biológicas em pesquisas de biologia marinha.
Para a nova pesquisa para este campo, acreditamos que o protocolo simplificado indicado deve ser a boa escolha para se exercitar. Após a anestesia, disseca e colete os intestinos anteriores, em seguida, selado as amostras de tecido verticalmente e remova o conteúdo interno. Lave as amostras de tecido em PBS duas vezes e desinfete-as por imersão em uma solução de 75% de etanol por não mais do que dois segundos.
Em seguida, lave as amostras de tecido em PBS três vezes para remover o etanol, e transfira cerca de 100 miligramas de amostra de tecido para um tubo micro centrífuga estéril de dois mililitros. Adicione 1,5 mililitros de cultura pré-otimizada ao bloco de tecido intestinal de pepino marinho e pique o bloco com uma tesoura cirúrgica esterilizada até que a solução esteja nublada. Adicione 400 microliters de 0,25% trypsin.
Misture a solução por inversão e incuba-a por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, filtrar a solução usando um coador de células de 100 mícrons e coletar o filtrado em um novo tubo de micro centrífuga de dois mililitros estéreis. Para o protocolo simplificado opcional, os blocos de tecido cortados em mídias cultivadas podem ser diretamente transferidos para pratos e posteriormente incubados.
Centrifugar o tubo a 1700xG por três minutos, descartar o supernasce, depois suspender novamente a pelota em meio de cultura com antibióticos, e lavá-lo com meio de cultura duas vezes. Pré-configure a incubadora para a cultura celular, e execute-a com antecedência por pelo menos 24 horas com a temperatura de 18 graus Celsius e umidade saturada. Em seguida, suspenda novamente as células usando 200 microliters de meio indicado, e transfira-as para pratos de quatro centímetros.
Cultume as células em uma incubadora. Depois de seis horas, tire-os da incubadora e adicione dois mililitros de médio indicado aos pratos de cultivo de células. A cada 12 horas, troque metade do meio.
Depois de cinco a sete dias, as células começam a se dividir. Reduza os efeitos adversos dos antibióticos reduzindo pela metade a concentração de antibióticos indicados, penicilina, estreptomicina e gentamicina no meio da cultura. A cada dois ou três dias, substitua o meio de cultura celular.
Quando a densidade celular primária atinge 60% de condução de passagem celular. Primeiro, lave as células cultivadas duas vezes usando PBS à temperatura ambiente. Adicione 200 microliters de solução de trypsin de 0,25% a cada prato, e agitar manualmente os pratos, garantindo que todo o fundo esteja coberto.
Descarte a solução de trippsina e incuba as células por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave as células com um mililitro de cultura fresca por pipetar e suspender as células. Transfira 0,5 mililitros de suspensão celular para um novo prato.
Adicione 1,5 mililitros de meio fresco e incuba as células a 18 graus Celsius. Após 12 horas, troque o meio e observe as células sob um microscópio para avaliar as condições. Prepare três grupos experimentais, incluindo um controle, e dois grupos de soluções, com um micromolar e 100 micromolar deximethazone.
Após a incubação com ou sem deximethazone por zero, 24 ou 48 horas, lave as células três vezes com PBS. Depois de desligar a luz, adicione 300 microliters de solução hoechst 33258 por poço a uma placa de 12 poços, e agitar suavemente a placa para cobrir todas as células, garantindo sua coloração. Incubar a 18 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, remova a solução de coloração hoechst e fixe as células adicionando 300 microliters de 4% de solução de paraformaldeído em PBS para cada poço. Agitar suavemente por 15 minutos. Depois disso, lave as células fixas três vezes em PBS.
Mantenha o PBS após a última lavagem para manter as células cobertas. Ligue o hardware do microscópio fluorescente, incluindo a potência da lâmpada de mercúrio, a potência da luz fluorescente e o PC. Faça login na conta do sistema operacional, inicie o software e verifique sua configuração. Coloque a placa preparada no estágio do microscópio.
Posicione a amostra sobre a lente objetiva usando o controlador de palco. Encontre as células de interesse sob o microscópio de luz. Mude para microscopia fluorescente e ajuste os parâmetros da excitação e emissão para aproximadamente 352 e 461 nanômetros, respectivamente, para observação de DNA de núcleos.
Capture as imagens. Neste estudo, foi estabelecida e permeada a cultura celular intestinal primária do pepino marinho. Células redondas em diferentes estágios de cultivo são mostradas aqui.
Aqui estão as células anexadas ao fundo dos pratos no terceiro dia, depois de serem semeadas. Aqui está a proliferação celular no sétimo dia. Aqui estão as células presas ao fundo dos pratos após a passagem.
E células que perderam atividade e estavam morrendo após 10 passagens. Os ensaios da EDU fornecem evidências diretas para revelar a atividade proliferativa dessas células redondas em estágios posteriores. A estimulação com um micromolar deximethazone aumentou a taxa de células apoptóticas mais rapidamente, em comparação com o controle e a estimulação deximethazone de 100 micromolar.
As células cultivadas foram tratadas com deximethazone por diferentes períodos de tempo, seguidas pela coloração hoechst 33258 para detecção de células apoptóticas. Tratamentos celulares antes da incubação são fundamentais para o controle a longo prazo. É um lembrete para tentar o protocolo opcional simplificado quando a célula não cresce bem.
O paraformaldeído é moderadamente tóxico pelo contato ou inalação da pele, e é documentado como um cancerígeno provavelmente humano.
