Assim, nosso modelo permite o estudo da modulação pós-transcricional de uma transcrição específica em células epiteliais alveolares na cultura primária e suas condições fisiológicas e fisioterícias. Assim, a transfecção transitória das células epiteliais alveolares primárias tem efeito mínimo sobre a fisiologia celular e metabolismos, o que representa uma clara vantagem sobre protocolos clássicos usando inibidores de transcrição. Para a geração de uma resposta plasmid expressando um gene de interesse, a sequência do gene e os múltiplos locais de clonagem do vetor indutível devem ser analisados para identificar as sequências de reconhecimento nos múltiplos locais de clonagem que não estão presentes internamente no gene.
Usando técnicas de polimerase taq de alta fidelidade e técnicas de PCR de sobreposição padrão, flanqueie o gene de interesse com dois sites de reconhecimento de enzimas de restrição selecionadas usando primers de designer. Uma sequência na codificação do epítope V5 a montante do gene de interesse deve ser incluída para distinguir a expressão do gene transfectado da expressão endógena. Mutantes podem ser gerados por exclusão sequencial para estudar os efeitos de diferentes três regiões não traduzidas na estabilidade do mRNA do gene usando primers reversos codificando um local de poliadenilação que gradualmente exclui as três extremidades principais da região não traduzida.
Em última análise, a inserção do gene de interesse pode ser confirmada pela análise de restrição. A orientação genética e a ausência de mutações potencialmente introduzidas durante o RTR podem ser confirmadas por sequenciamento. Para a transfecção do pulmão primário do pulmão de rato tipo duas células epiteliais alveolares, semeou as células em uma única vez 10 para a sexta células por centímetro quadrado em placas de Petri de 100 milímetros na presença de meio essencial mínimo completo.
Cultura por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com umidade. No dia seguinte, adicione 500 microliters de meio completo sem antibiótico a cada poço de uma nova placa de 12 poços e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante esta incubação, adicione um micrograma do plasmídeo de resposta e um micrograma de vetor regulatório a um tubo de 1,5 mililitro por poço.
Lave as células epiteliais alveolares com 10 mililitros por poço de 37 graus Celsius PBS sem cálcio ou magnésio e trate as células com cinco mililitros por poço de 37 graus Celsius 0,05% trypsin por dois a quatro minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separarem, neutralize a trippsina com 10 mililitros por poço de meio completo sem antibiótico e colete as células em um novo tubo de 50 mililitros. Lave o prato com quatro mililitros de meio fresco para coletar quaisquer células restantes e sedimentar as células por centrifugação.
Resuspend a pelota em um mililitro de PBS para contar e centrifugar as células novamente. Resuspense a pelota a uma densidade de quatro vezes 10 a sete células por mililitro de tampão de resuspensão e adicione quatro vezes 10 às quintas células a cada tubo de plasmídeo e vetor com mistura suave. Coloque um tubo no dispositivo de eletroporação e encha o tubo com 3,5 mililitros de tampão eletrolítico.
Deprimir completamente o pistão para inserir uma ponta de eletrodo banhado a ouro em uma pipeta e misturar suavemente o conteúdo do tubo. Aspire cuidadosamente as células com uma pipeta e insira a pipeta na estação de eletroporação até que um som de clique seja ouvido. Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.
Imediatamente após a transfecção, remova a pipeta e transfira as células para um poço da placa pré-aquecida de 12 poços. Quando todas as células tiverem sido eletroporadas e banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular, substituindo o supernaente em cada poço por meio completo por antibióticos após dois dias. O sucesso da transfecção pode ser confirmado pela expressão de EGFP, como observado pela microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo usando um vetor de controle.
Para inibir a transcrição do gene de interesse, 72 horas após a transfecção substituem o supernatante por um mililitro por poço de meio completo suplementado com um micrograma por mililitro de adoxiciclina recém-preparada. Para avaliar a meia-vida mRNA do gene de interesse, devolva a placa à incubadora de cultura celular de 15 minutos a seis horas. Lavar um poço com um mililitro de PBS gelado antes de lise as células com 500 microliters de tampão de lise de um kit de extração de RNA fenol phenol disponível comercialmente e agitação suave em cada ponto de tempo experimental.
Em seguida, isole o RNA de acordo com as instruções do kit e determine o rendimento e pureza do RNA por espectrofotometria em 230, 260 e 280 nanômetros. Para determinar a estabilidade do RNA isolado, primeiro trate um micrograma do RNA total de cada amostra com DNase livre de RNase para remover quaisquer traços de DNA plasmídeos. Use um kit de síntese cDNA comercialmente disponível com uma mistura de oligo dT e primers hexomer aleatórios para melhorar a eficiência de transcrição reversa para reverter transcrever o RNA total esgotado de DNA em cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
Adicione 180 microliters de água de grau de biologia molecular aos 20 microliters da mistura de reação para diluir a reação de CDNA a um nanograma de cinco nanogramas por concentração de microliter e diluir imediatamente a mistura de cDNA com água de grau de biologia molecular fresca para atingir um nanograma de 1,25 nanograma por concentração de microliter. Combine cinco microliters de mistura mestre de corante verde cibernético com 0,1 microlitr de água de grau de biologia molecular, 0,45 microliters de 7,5 micromolars para a frente, 0,45 microlitres de 7,5 micromolar reverso primer, e quatro microliters de 1,25 nanograma por microlitra de cDNA para obter um volume total de reação de 10 microliters. Coloque as amostras em um termociclador qPCR e amplify o gene de interesse da tag V5 e os amplificadores de avanço do transactivador de tetroclina utilizando as condições qPCR conforme indicado e gere uma curva de fusão de alta resolução para avaliar as temperaturas específicas de fusão dos amplicons desejados e garantir a ausência de picos de amplicon de ruído.
Esta técnica de eletroporação pipeta facilita uma taxa de eficiência de transfecção de 25 a 30%, conforme observado pelas razões das células EGFP detectadas por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. O tratamento de células epiteliais alveolares com um micrograma por mililitro de doxiciclina não tem impacto significativo na expressão do endogênio alfa ENaC mRNA a qualquer momento durante o período de tratamento. Usando um sistema de expressão plasmídeo controlado transcricionalmente, como demonstrado, o sinal V5 alfa ENaC poderia ser normalizado de acordo com o sinal avançado do transactivador de tetraciclina para determinar a eficiência da transfecção usando o método de ciclo de quantificação delta duplo.
A meia-vida do alfa ENaC mRNA é até sete vezes menor na presença da tetraciclina fora do sistema do que na presença de actinomicina D, confirmando que a actinomicina D leva a uma estabilização artefato alfa ENaC mRNA. Além disso, o tratamento alfa do fator ciclohexamida e necrose tumoral diminuiu significativamente a estabilidade da transcrição, enquanto lipopólises não. Mudanças significativas na modulação da estabilidade do ENaC alfa V5 podem ser induzidas dependendo das regiões excluídas e incluídas das três principais regiões não traduzidas.
Além disso, a expressão sobre de proteínas específicas de ligação de RNA diminui a estabilidade de 5 alfa ENaC mRNA em comparação com a transfecção com um pcDNA vazio três plasmídeos. Esta ferramenta será útil para consultar novas percepções sobre a regulação pós-transcrição dos genes-chave envolvidos na função do epitélio alveolar e suas condições fisiológicas ou patológicas.
