O objetivo geral deste protocolo é fornecer orientação detalhada para usar o minigene E1A2 para avaliar as mudanças globais de emenda mRNA. Trata-se de uma ferramenta rápida, barata e simples para avaliar a função da proteína-alvo na regulação alternativa de emendas sem a necessidade de regimes especiais ou condições laboratoriais. Comece por estacionar células HEK 293 com expressão estável do gene de interesse.
Divida as células usando 0,25% de trippsina EDTA, depois a placa 300.000 células por poço em placas de seis poços e incuba-as por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, verifique a confluência e transfete as células estáveis HEK 293 somente quando 70 a 80% confluentes. Remova cuidadosamente o meio de cultura celular com uma pipeta, em seguida, adicione dois mililitros de meio DMEM completo sem antibióticos e coloque a placa de volta na incubadora.
Prepare um tubo com o tampão de transfecção, em seguida, adicione dois microgramas de DNA pMTE1A, vórtice, e adicione dois microliters de reagente de transfecção. Vórtice novamente e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Retire as placas da incubadora e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção em termos de gota.
Seis horas após a transfecção, adicione tetraciclina às células estáveis HEK 293 para indução de expressão nek4. 24 horas após a transfecção, verifique a morfologia celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio fluorescente. Use uma pipeta para remover o meio de cultura celular e adicione meio de cultura celular com a quimioterápico.
Incubar as células por mais 24 horas. Para coletar RNA, descarte o meio de cultura celular e adicione 0,5 a 1 mililitro de reagente de extração de RNA diretamente ao poço. Se os poços forem muito confluentes, use um mililitro de reagente de extração de RNA para melhorar a qualidade do RNA.
Homogeneize as células com uma pipeta e transfira-as para um tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Prossiga imediatamente para a extração de RNA, ou armazene as amostras a menos 80 graus Celsius. Descongele as amostras em um capô de fumaça e incuba por cinco minutos em temperatura ambiente.
Adicione 0,1 a 0,2 mililitros de clorofórmio e se agitar vigorosamente, depois incubar por três minutos em temperatura ambiente. Centrífuga por 15 minutos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius, depois colete a fase aquosa superior e transfira-a para um novo tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Coletar cerca de 60% do volume total, mas não coletar o DNA ou a fase orgânica.
Adicione 0,25 a 0,5 mililitros de isopropanol e agitar a amostra por inversão quatro vezes. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, depois centrífuga a 12.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe. Lave a pelota de RNA duas vezes com etanol, e centrífuga a 7.500 vezes G por cinco minutos, depois descarte o etanol.
Remova o excesso de etanol invertendo o tubo em uma toalha de papel, depois deixe o tubo aberto dentro de um capô de fumaça para secar parcialmente a pelota por cinco a 10 minutos. Suspenda a pelota de RNA em 15 microliters de água tratada com DEPC. Quantifique o RNA total e verifique a qualidade do RNA medindo a absorvância em 230, 260 e 280 nanômetros.
Para verificar a qualidade total do RNA, execute um gel de 1%agarose pré-tratado com 1,2% de uma solução de hipoclorito de sódio de 2,5% por 30 minutos. Realize a síntese de CDNA usando um a dois microgramas de RNA total. Combine RNA, um microliter de oligo d-T, um microliter de DNTP, e água sem nuclease a 12 microlitadores.
Incubar a reação no Thermo Cycler por cinco minutos a 65 graus Celsius. Remova amostras do Thermo Cycler e adicione quatro microliters de buffer de transcriptase reversa, dois microliters de DTT e um microliter do inibidor de ribonuclease. Incubar a 37 graus Celsius por dois minutos.
Adicione um microliter de transcriptase reversa termo-estável e incubar a 37 graus Celsius por 50 minutos. Inativar a enzima a 70 graus Celsius por 15 minutos. Realize o PCR como descrito no manuscrito do texto, em seguida, carregar 20 a 25 microliters do produto PCR em um gel de 3%agarose contendo mancha de ácido nucleico, e executado a 100 volts por aproximadamente uma hora.
Fotografe o gel, evitando qualquer saturação de banda, e quantifique as bandas usando um software de processamento de imagem. As bandas com 631, 493 e 156 pares de base correspondem aos isoforms 13S, 12S e 9S, respectivamente. No menu Arquivo do software, abra o arquivo de imagem e converta-o em escala cinza.
Ajuste o brilho e o contraste e remova o ruído mais estranho, se necessário. Desenhe um retângulo ao redor da primeira faixa com a ferramenta de seleção de retângulos e selecione-o através do comando Analisar, Gels e Selecionar Primeira Faixa, ou usando o atalho do teclado. Use o mouse para clicar e segurar no meio do retângulo na primeira pista e arrastá-lo para a próxima pista.
Vá para Analisar, Gels e Selecionar Próxima Pista. Repita esta etapa para todas as faixas restantes. Depois de todas as faixas serem destacadas e numeradas, vá até Analyze, Gels e Plot Lanes para desenhar um enredo de perfil de cada pista.
Use a ferramenta de seleção em linha reta para desenhar uma linha através da base de cada pico, correspondendo a cada banda, deixando de fora o ruído de fundo. Depois de todos os picos de cada pista terem sido fechados, selecione a ferramenta varinha e clique dentro de cada pico. As medições devem aparecer na janela de resultados para cada pico destacado.
Considere apenas os picos de 13S, 12S e 9S correspondentes a 631, 493 e 156 bandas de pares de base. Copie dados de intensidade para um editor de planilhas e ressira a intensidade das três bandas para cada amostra e, em seguida, calcule a porcentagem de cada isoforme em relação ao total. Plote as porcentagens de cada isoforme ou as diferenças na porcentagem em relação às amostras não tratadas.
Utilizou-se um plasmid contendo o minigene de E1A para observar o efeito sobre o splicing alternativo, avaliando a proporção de mRNA de cada isoforme produzido. A expressão basal das variantes isoformas E1A dependia da linha celular e do tempo de expressão E1A. A linha de células estáveis HEK 293, ou HEK 293 recombinase contendo o local, mostrou uma expressão mais elevada de 13S em comparação com as células HeLa, mas mostrou níveis semelhantes de isoformes 13S e 12S após 48 horas de expressão E1A.
Células expostas à cisplatina mostraram uma mudança em cinco seleção de splicing S-S prime favorecendo a expressão 12S. Este efeito foi observado em HEK 293 expressando o vetor vazio da Bandeira, bem como isoforme um de Nek4. As mudanças na emenda alternativa após o tratamento do paclitaxel foram muito discretas, mas as direções das mudanças foram opostas nas células expressas Flag e Nek4.
Ao executar este protocolo, é importante usar controles de transcriptase não transtrafetos e não reversos para evitar interpretações erradas com expressão Endógena E1A, principalmente quando se usa células HEK 293. Após a obtenção de resultados positivos, pode-se avaliar o splicing alternativo de genes específicos relacionados à resposta quimioterápico. Quando algum efeito é observado, este protocolo simples pode direcionar esses estudos para caminhos mais consistentes, onde a proteína desempenha um papel regulando a emenda alternativa na resposta à quimioterapia, por exemplo.
