O comprometimento cognitivo é uma das co-morbidades mais comuns na epilepsia do lobo temporal. Apresentaremos um protocolo descrevendo como avaliar o prejuízo de memória usando um modelo de camundongo de epilepsia crônica. A localização do objeto novo, o reconhecimento de objetos novos e o teste de separação de padrões são bundas simples e curtas que podem estressar minimamente os animais.
Torna este teste ideal para avaliar a função de memória em camundongos epilépticos, sem gatilhos adicionais para convulsões recorrentes espontâneas. Para começar, aclimatar os animais à luz baixa em suas gaiolas, por pelo menos 30 minutos. Prepare uma caixa de campo aberto.
No primeiro dia da habituação, lugar e illuminômetro no centro da caixa de campo aberto. E ajuste a iluminação para 60 Lux. Para avaliar a atividade locomotor de cada mouse, use o software de rastreamento de vídeo de comportamento animal.
Uma vez aberto o software de rastreamento de vídeo, calibrar o tamanho da caixa de campo aberto. Em seguida, coloque suavemente um mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede. Abra o programa Smart, clique em Personalizado e Aceito.
Clique na Fonte da imagem. Depois de selecionar a câmera instalada, pressione o botão Definir. Ajuste a resolução da câmera e pressione, Aceite.
Após o clique de calibração, arraste o mouse do computador para se adequar ao tamanho da caixa. E preencha o tamanho da caixa interna. Clique em Definição de zona para salvar e ajustar cada tamanho da caixa e, em seguida, clique em Salvar.
A caixa vermelha é o intervalo rastreado, por isso se encaixa no tamanho da caixa interna, enquanto a caixa rosa se encaixa no contorno. Configuração de detecção de pressão. Clique em Snapshot e pressione o Teste de Início, para verificar se uma área específica está rastreada, em seguida, pres Stop Test e, em seguida, Aceitar.
Clique em Configurações de tempo. Depois de selecionar o tempo de predefinição, defina o tempo de latência, em três segundos de tempo de aquisição para 15 minutos e pressione Aceitar. Pressione os sujeitos para definir o codinome.
Clique em Agendar, para excluir os detalhes existentes e arrastar o nome de código modificado em sujeitos para a sessão um. Clique em Aquisição de Dados. Clique no botão Gravar e clique em Iniciar.
Coloque o mouse na caixa e rastreie-o por 15 minutos. Após 15 minutos de gravação, devolva o rato para sua gaiola. Restaure a luz brilhante.
Clique em Aquisição de Dados. E, em seguida, clique em Análise Ativa Arrastar o nome de código Sham para a janela ao lado. Clique no botão Definição de relatório.
Clique no botão Novas Definições de Relatório, em relatório de resumo e pressione Aceitar. Clique em Nome de Assunto e Distância na Região e envie-o para o lado. Em seguida, pressione o botão Aceitar.
Clique na marca de verificação vermelha e clique em Analisar. Veja os resultados. No segundo dia, e terceiro dia, repita as sessões de habituação.
No quarto dia, realize a sessão de familiarização. Na luz fraca, coloque cada rato no campo aberto vazio por três minutos. Após esta breve habituação, devolva o animal para sua gaiola.
Coloque dois objetos idênticos, bonecos de borracha, na arena de campo aberto, a cinco centímetros de distância das paredes adjacentes. Fixar os objetos com fita dupla face. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos.
Permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Não quantifique como tempo exploratório, quaisquer comportamentos, em que o focinho animal não aponte para o objeto. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração de 30 segundos, para os dois objetos, pare a sessão de F1 e transfira o mouse para sua gaiola doméstica.
Se o mouse não explorar os objetos por 30 segundos dentro dos 20 minutos, remova o mouse da caixa de campo aberto e exclua-o de outras sessões. No quinto dia, realize a nova sessão de teste de localização de objetos. Transfira o rato para a área de campo aberto para a reabilitação por três minutos.
Então devolva-o para sua gaiola. Mova um objeto para a posição diagonal e coloque o mouse experimental voltado para a parede da caixa de campo aberto. Permita 10 minutos de exploração gratuita e grave com um sistema de rastreamento de vídeo.
Meça, o tempo gasto explorando cada objeto, usando dois cronômetros. Em seguida, transfira o rato para sua gaiola, agarrando a cauda. Durante três dias, deixe o mouse descansar com acesso gratuito a comida e água.
No nono dia, faça uma sessão de habituação de 15 minutos, para um rato. No dia 10, realize a breve sessão de reabilitação, por três minutos. Então, temporariamente, devolvê-lo para sua gaiola.
Coloque dois objetos idênticos, tubos plásticos de 50 mililitros cheios de 40 mililitros de água, no campo aberto, a cinco centímetros de distância das paredes adjacentes. Introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto, de frente para a parede mais distante dos objetos. Como o rato será exposto aos dois objetos diferentes no Teste NO, um tubo de plástico de 50 mililitros cheio com 40 mililitros de água, e um frasco de frascos de vidro Coplin.
Contrabalancear o objeto durante a sessão de familiarização, apresentando dois objetos idênticos, frascos de vidro coplin, para metade dos animais do grupo. Em seguida, com dois objetos diferentes, permita a exploração gratuita por 20 minutos e meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros. Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de expiração de 30 segundos para ambos os objetos, pare a sessão de familiarização.
No dia seguinte, realize a nova sessão de teste de reconhecimento de objetos. Primeiro, transfira o rato para o campo aberto para a reabilitação, por três minutos, e depois devolva-o para sua gaiola. A cinco centímetros de distância das paredes adjacentes, substitua o tubo por um frasco de frascos de vidro Coplin, de modo que os ratos sejam expostos a um tubo e um frasco de frascos de vidro Coplin.
Para metade dos animais que foram expostos a frascos de vidro coplin durante a primeira sessão de familiarização, substitua o frasco de frascos de vidro Coplin por um tubo plástico de 50 mililitros cheio com 40 mililitros de água. Para que os ratos sejam expostos a um tubo e um frasco de frascos de vidro Coplin. Permita 10 minutos de exploração gratuita durante a gravação usando um sistema de rastreamento de vídeo.
Então pegue a cauda do rato experimental, e transfira-o para sua gaiola. Por três dias e deixe o rato descansar com livre acesso a comida e água. Para a análise NL, abra o Programa Iniciar Personalizado e Aceito.
Clique na Fonte da imagem. Depois de selecionar a câmera instalada, pressione o botão Definir. Apenas a resolução da câmera e pressione Aceitar.
Clique em Abrir vídeos Botão pasta para abrir o vídeo salvo. Assista ao vídeo salvo por 10 minutos a partir do momento em que o mouse entra e meça o tempo gasto explorando cada objeto. No dia 15, realizou pela primeira vez a primeira sessão de familiarização para o Teste PS.
Isso é para o rato para a área de campo aberto para reabilitação, por três minutos. Coloque a placa do chão com a grade larga e dois objetos idênticos. Frascos T de plástico cheios de 50 mililitros de água, na caixa de campo aberto.
Em seguida, introduziu o mouse experimental na caixa de campo aberto de frente para a parede mais distante dos objetos. Permitir a exploração gratuita por 20 minutos. E meça manualmente o tempo gasto explorando ambos os objetos usando dois cronômetros.
Uma vez que o mouse atinja o tempo mínimo de exploração de 30 segundos para ambos os objetos, pare a primeira sessão de familiarização e transfira o animal para sua gaiola doméstica. Para contrabalançar o objeto e o teste de separação de padrões para metade dos animais coloque a placa do chão com a grade larga e dois objetos idênticos, garrafas de vidro para o experimento de balanceamento do contador na caixa de campo aberto. Em seguida, introduza o mouse experimental na caixa de campo aberto e permita a exploração gratuita por 20 minutos.
Uma vez que o rato atinja o tempo mínimo de exploração de 30 segundos para os dois objetos, pare a primeira sessão de familiarização e transfira o animal para sua gaiola doméstica. No dia seguinte, transfira o rato para a área de campo para reabilitação por três minutos. E depois devolvê-lo para sua gaiola.
Em seguida, realize a segunda sessão de familiarização com duas garrafas de vidro no piso da grade estreita. Para os experimentos de contrabalanciamento, realize a segunda sessão de familiarização com dois frascos T cheios de água no piso estreito da grade. No dia seguinte, realize a sessão de teste de separação de padrões.
Transfira o mouse para a área de campo aberto sem objeto para reabilitação por três minutos. E depois devolvê-lo para sua gaiola. Em seguida, coloque o frasco T cheio de água e uma garrafa de vidro no piso estreito da grade.
Faça os frascos T cheios de água, em novo objeto. Para experimentos de contrabalanciamento, coloque cada objeto no piso da grade estreita para fazer da garrafa de vidro um objeto novo neste caso. Em seguida, para o mouse experimental para a área de campo aberto por 10 minutos para explorar.
Permita 10 minutos de exploração gratuita e grave usando um sistema de rastreamento de vídeo. Pegue a cauda do rato experimental e transfira-o para sua gaiola. Meça o tempo gasto explorando cada objeto usando dois cronômetros.
E calcular a razão de discriminação igualando a diferença de tempo gasto entre o objeto novo e o objeto familiar dividido pelo tempo total explorando os dois objetos. Seis semanas após a introdução de pilocarpina induzida convulsões agudas. Os ratos serão submetidos ao novo teste de localização do objeto.
Novo teste de reconhecimento de objetos e teste de separação de padrões. Nessa ordem separados por três períodos de descanso durante os três dias entre os testes. Foi confirmado que não havia preferência significativa entre os dois objetos apresentados juntos.
Os camundongos epilépticos apresentaram uma redução significativa na razão de discriminação nos três testes em comparação com os controles de Sham. Demonstrando prejuízo de memória espacial. A medição da atividade locomotor, mostrou um aumento significativo nos animais epilépticos.
Considerando que a motivação para explorar os objetos era comparável entre Sham e animais epilépticos. Finalmente, a morte das células hipocampais foi avaliada após um pilocarpina induzir estado epiléptico usando coloração violeta cristalina para confirmar que a convulsão induziu danos neuronais. Os animais tratados com pilocarpina demonstraram células pitnóticas no subcampo ca3 do hipocampo, ao contrário dos controles de Sham.
A contagem em teste NO e PS é fundamental para reduzir o viés inerente possível neste dispositivo de objetos específicos. Além disso, ratos epilépticos crônicos abertos mostram ansiedade aumentada, o que requer múltiplos passos de habituação para nação de aclamação suficiente para as configurações experimentais. modificações de tempo, como o número ou a localização dos objetos em nosso protocolo podem fornecer os testes de memória.
O que pode ser útil para elaborar mecanismos complexos de epilepsia associados ao declínio cognitivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar diferentes aspectos do prejuízo de memória na epilepsia.
