Somos gratos a Leonie de Boer e Bas Zaat (Academic Medical Centre) para fornecer-nos com o S. epidermidis O-47 tensão. Agradecemos Rico Bongaarts, Francis Smet e Angela Comas (União Biométrica) para ajuda e conselhos com a COPAS XL e análise BioImager vasto. Agradecemos Davy de Witt, Ulrike Nehrdich e Laura van Hulst para guarda pescar, e outros colegas da Universidade de Leiden para discussões úteis. Esta pesquisa faz parte do Projeto P5.03 IBIZA do programa do BioMedical Materiais instituto, co-financiado pelo Ministério dos Assuntos Económicos holandês de pesquisa e do Programa Mix Inteligente (NWOA_6QY9BM) do Ministério dos Assuntos Económicos neerlandês e de O Ministério Holandês de Educação, Cultura e Ciência. Apoio adicional foi obtida a partir do projecto da UE ZF-Saúde (FP7-Saúde-2009-242048) e RMJ foi apoiado por bolsa Marie Curie como pesquisador experiente na Formação Inicial Rede FishForPharma (PITN-GA-201 UE1-289209). SJR recebeu financiamento da Medicamentos Inovadores empresa comum Iniciativa sob contrato de subvenção n ° 115337, os recursos dos quais são compostos de contribuição financeira do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) e empresas EFPIA em autores contribution.The amáveis ​​também reconhece apoio financeiro do Fundo Universidade de Leiden (LUF) para robótica e de Cyttron, no programa de Subsídios Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, que por sua vez é apoiado financeiramente pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica para instalações de imagem. A aquisição do sistema COPAS foi parcialmente financiado pela Divisão de Ciências da Terra e da Vida (ALW) com ajuda financeira da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO, 834.10.004).

1. Estirpes bacterianas e condições de crescimento <ol><li> Prepare S. epidermidis inóculo <ol><li> Tome várias colônias individuais de S. epidermidis estirpe S-47, que contém um derivado pWVW189 mCherry vector de expressão (De Boer L. não publicados) a partir de um Luria Bertani (LB) placa de agar suplementado com 10 ug / ml de cloranfenicol e cultura durante a noite a 37 ° C em 25 ml de meio LB suplementado com 10 ug / ml de cloranfenicol a fase midlog. </li><li> Centrifugar 1 ml de cultura a 12000 xg durante 1 min e, subsequentemente, lavar 3x deles com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) com 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir a densidade óptica a 600 nm (OD 600), e dilui-se a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,3 a 2% (w / v), polivinilpirrolidona 40 (PVP 40) em PBS. Nota: Uma OD600 de 0,3 corresponde a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colónias / ml (UFC / ml). </li></ol&gt; </li><li> Prepare M. marinum inóculo <ol><li> Tome várias colônias individuais de M. marinum estirpe M ou E11 contendo o vector pSMT3-mCherry expressando estavelmente mCherry 10 a partir de uma placa de agar Middlebrook 7H10 com 10% (v / v) Middlebrook OADC enriquecimento suplementado com 50 ug / ml de higromicina e cultura durante a noite a 28 ° C em 10 ml de caldo Middlebrook 7H9 com 10% (v / v) suplemento Middlebrook ADC suplementado com 50 ug / ml de higromicina. </li><li> Centrifugar 1 ml de cultura a 12000 xg durante 1 min e, subsequentemente, lavar 3x com 1 ml de PBS estéril com 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir a OD 600, e dilui-se a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,3 a 2% (w / v) de PVP 40 em PBS. Nota: Uma OD600 de 1 corresponde a 1,0 x 10 8 ufc / mL. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Zebrafish Eggs <ol><li> Coloque um máximo de 70 do sexo masculino e 50 do sexo feminino ty selvagempe zebrafish separadamente para o grande navio de reprodução. Nota: Coloque o peixe fêmea na parte inferior do vaso grande de reprodução. </li><li> Retire o separador no dia seguinte, pela manhã, para deixar o peixe-zebra iniciar a reprodução. </li><li> Recolher os ovos na parte inferior do recipiente grande de reprodução através do colector de ovo em um tubo de 50 ml cheio com água do ovo (60 ug / ml de sal do mar do oceano instante). </li></ol> 3. Agulhas de injeção <ol><li> Obter comercialmente disponíveis à medida capilares de vidro agulhas com um diâmetro interno de 10 um. </li></ol> 4. Delineamento experimental de Injeção <ol><li> Ferva 100 ml de 1% (w / v) de agarose em água ovo e fresco até cerca de 40 º C. Despeje de agarose em placa de microinjetores automatizado e colocar a 1.024 bem selo na agarose. Nota: A placa está pronta para usar quando arrefecido. </li><li> Por software operacional clique microinjetor automatizado em &#39;Calibrar palco &quot;,em seguida, clique em &#39;1024 &#39;bem grade e colocar a placa de agarose no microinjetor e calibrar a placa clicando na tela na posição central do poço. </li><li> Ir para &#39;menu de agulha&#39; e clique em &#39;porta-agulhas calibrar&#39;. </li><li> Preencha a agulha de injeção usando uma dica microloader com 10 mL pvp 40 contendo 100 ufc / nl S. epidermidis ou 30 ufc / nl M. marinum ou uso pvp 40 como injeção simulada. </li><li> Coloque a agulha no micro-injector automático e calibrar a posição x, y, diminuindo ou mover a agulha para cima e clicando na tela na posição da agulha. Em seguida, calibrar a posição z da agulha clicando na tela na posição da ponta da agulha. </li><li> Distribua os ovos sobre a grade de agarose, utilizando uma pipeta de transferência de plástico e retire o excesso de água do ovo. Coloque a grade de agarose na microinjetor automatizado. </li><li> Vá para a &#39;injectioMenu n &#39;e ajustar a &quot;pressão de injeção&#39; definindo a 200 hPa,&quot; tempo de injeção &quot;0,2 seg e &#39;pressão Compensação&#39; 15 hPa, o que se correlaciona com um nl, no menu de configurações FemtoJet. </li><li> Clique em &#39;Injetar tudo&#39; para injetar toda a placa. </li><li> Recolher os ovos depois da injecção, lavando-as em placas de Petri (92 x 16 mm), com um máximo de 70 embriões por placa de Petri, e incuba-se a 28 ° C. </li></ol> 5. Análise de Fluxo-citômetro <ol><li> Prepare o grande fluxo de partículas citômetro de acordo com as instruções do fabricante e encher o copo de amostra e recipiente de fluido do invólucro com água de ovo. </li><li> No software operacional, vá ao menu &quot;PMT&quot; e use as seguintes configurações: 650 V para o canal &#39;Red&#39; e 0 V para o &quot;verde&quot; e os canais de &#39;amarelo&#39;. Em seguida, vá ao menu &quot;Limites&quot; e use as seguintes configurações: &#39;Optical densidade &quot;sinal limiar: 975 mV (valor COPAS XL: 50) eo&quot; Time of Flight &quot;(TOF) mínimo de 320 ms (valor COPAS XL: 800), a fim de reduzir a influência de detritos. </li><li> Para a análise, sem classificar os embriões vá para o passo 5.4, para análise e classificação dos embriões em uma placa de Petri vá para o passo 5.5 ou para análise e classificação dos embriões em uma placa de 96 poços vá para o passo 5.6. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e clique em &#39;start&#39; para iniciar a análise. Quando se analisam todos os embriões parar a análise, clicando em &#39;stop&#39;. Salve os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e definir o máximo de 70 embriões por placa para ser resolvido inserindo 70 no menu &#39;Ordenar&#39;. Coloque um prato vazio Petri sob o classificador e clique em &#39;Ordenar Manual&#39;. Quando o di Petri<html> sh é preenchido, salvar os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e definir o máximo de 1 embrião por poço para ser resolvido inserindo 1 no menu &#39;Ordenar&#39;. Coloque um vazio placa de 96 poços no suporte da placa esquerda e clique em &#39;Preencher placa&#39;. Quando a placa de 96 poços está cheio, salvar os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Obter o arquivo TXT para processar os dados brutos, use as seguintes configurações de filtro de dados: &#39;Status selecionar&#39;: 40, e se estiver usando o módulo de tipo &#39;tipo de Status&#39;:. 6 Em seguida, use os números do sinal total de fluorescência do &#39;Red &#39;canal para calcular a média e o erro padrão da média. Enredo esses conjuntos de dados em bar ou dispersão gráficos. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Tratamento Medicamentoso <ol><li> Analisar e injeção tipo em 3 dias após (dpi), M. marinum embriões infectados em dois grupos iguais usando o fluxo de partícula grande citômetro (passo 5.5). Tratar um grupo com um composto de interesse na sua solvente transportador e outro com veículo solvente sozinho (controlo). Aplicar tratamentos semelhantes para zombar controle injetado para testar os efeitos colaterais de antibióticos. </li><li> Repita a 4 e 5 de dpi a análise (passo 5.5) e refrescar a água de ovo ou água ovo contendo o composto. </li></ol> 7. Alta resolução de imagem <ol><li> Anestesiar os embriões com 0,02% (w / v) tamponada de éster etílico do ácido 3-aminobenzóico (tricaina) em água ovo 10 min, antes da análise. </li><li> Prepare o sistema de rastreio tecnologia automatizada de Vertebrados ea partícula grande amostrador de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Selecione as imagens de referência correspondente à idade dos embriões do &quot;Imaging - Objeto211; Menu de configuração de detecção ». </li><li> Selecione a quantidade de fotos e orientação a ser feita pelo sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados Automated do &quot;Imaging - loja Auto imagens &#39;menu. </li><li> Coloque uma placa de 96 poços cheios de embriões (a partir do passo 5.6) para o suporte da placa esquerda do Grande Particle Sampler, e clique em &#39;placa funcionar &quot;. </li><li> Quando um embrião é detectado e correctamente posicionado; imagem da cabeça e do rabo separadamente com o CLSM usando um 10X objetivo planície seca e costurar as imagens depois usando o software de processamento de imagem. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS é proprietário de Life Science Métodos BV que produz instrumentos utilizados neste artigo.

A metodologia de alto rendimento descrito neste artigo fornece um pipeline eficaz rápido eo custo para a tela grande número de embriões e larvas de peixes com diferentes tipos de infecções. Usando o grande vaso de reprodução em vez de tanques tradicionais individuais ou familiares de reprodução facilitado o controlo do processo de reprodução e geração de um maior número de ovos síncronos. Com uma versão aperfeiçoada do sistema de micro-injecção automático 7, é possível injectar-se a 2.500 ovos quase todos na mesma fase de células dentro de uma hora. Com essas atualizações e software melhorado é viável para injetar mais ovos do que antes era possível, que podem ser utilizados para a realização de grandes telas de drogas com a proliferação de bactérias como a ler. No entanto, este método é ainda limitada a gema de injecção, outras vias de injecção, por exemplo, descritos por Benard et al. (2012) 6, venha a ser incorporado no sistema de micro-injeção automatizada em um futuro próximo. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora estes métodos são referenciados para a triagem de peixe-zebra, que seria útil para aplicações com outras espécies de peixes também. Por exemplo, a carpa comum foi indicado para ter vantagens para as telas de drogas. Como peixe-zebra, ovos e embriões em estágio inicial de carpa comum são transparentes, mas com a principal vantagem de seu grande tamanho desova de centenas de milhares de ovos e da disponibilidade de linhas puras, que oferecem uma base genética mais constante 16. A análise de grandes quantidades de embriões infectados é feito com a alta taxa de grande fluxo de partículas citómetro. Este dispositivo pode embriões espécie analisada em placas de cavidades múltiplas ou uma placa de Petri, tornando-o especialmente adequado para testar um grande número de compostos. Se for necessária uma resolução de imagem maior, do que a configuração é adaptado de maneira que o fluxo de partículas grande citómetro tecnologia pode ser utilizada para pré-triagem e posteriormente analisar as amostras de um meio atravéscolocar em uma resolução maior. Isso pode ser feito usando a tecnologia de Triagem de Vertebrados Automated 17, 18. Este dispositivo pode automaticamente coletar embriões vivos ou fixas, entre 2 e 7 dias após a fecundação de uma placa de multi bem ou contentor para granel, imagem 360 ° através de um capilar usando CLSM ou microscopia estéreo e dispor de novo em dois contentores para granel, permitindo triagem manual dos embriões com base nas imagens microscópicas. Futuras melhorias permitirão a classificação do embrião após imagiologia no poço da placa multi, portanto, tornando-se possível a tela automaticamente grande número de embriões individuais ao longo do tempo com CLSM. Supondo que, em aplicações futuras do sistema Tecnologia Triagem Vertebrados automatizada pode também ser ligado ao grande fluxo de partículas citómetro tecnologia, sem a necessidade de distribuição de larvas antes em placas de multi-poços, irá conduzir a uma classificação mais avançada. Este artigo descreve a um estabelecimentootimização d de uma configuração de alto rendimento para estudar S. epidermidis e M. infecção marinum como um modelo para a descoberta da droga. Isto demonstra que os resultados destas bactérias injectadas na gema depende do estágio de desenvolvimento dos ovos, no momento da injecção. Injetando M. marinum E11 em 16-128 estágio de célula ou a tensão M em 16-64 estágio de célula leva o mesmo padrão de infecção como a injeção veia caudal 2, 6. No entanto, esta configuração não está limitado a apenas a proliferação de bactérias patogénicas. Foi demonstrado anteriormente que é possível injectar roboticamente soluções contendo ADN, ARN ou morpholinos para transgénese, sobre-expressão e o gene knock-down estudos, respectivamente 13. Além disso, demonstrou-se que esta configuração é também útil para o estudo da proliferação de células cancerosas e a migração. Portanto, esta conduta apresenta um método versátil para telas de elevada capacidade de uma variedade de mecanismos de sinal no contextoda imunidade inata, aplicada a doenças infecciosas eo desenvolvimento de câncer. Estas telas podem ser combinados com outros para a descoberta de medicamentos, mas também com a análise de possíveis efeitos tóxicos de drogas aplicáveis ​​identificados.

Até à data, o peixe-zebra (Danio rerio) foi estabelecida com sucesso, como um modelo eficiente para estudar uma variedade de doenças infecciosas 1. O embrião de peixe-zebra oferece possibilidades de imagem única em vivo devido à sua transparência e ao grande número de linhas repórter transgênicas existentes que expressam proteínas fluorescentes. Esta poderosa combinação torna possível controlar diferentes tipos de células imunes no tempo, enquanto interagindo com patógenos, como Mycobacterium marinum, o parente mais próximo de M. tuberculose 2 ou Staphylococcus epidermidis, o principal causador do biomaterial associado infecção 3-5. Diferentes vias de infecção pode ser usado em embriões de peixe-zebra, dependendo dos propósitos do estudo 6. Uma dessas vias de infecção é gema de injecção das bactérias. A principal vantagem deste método em comparação com os outros é que infecti gemana pode ser realizada automaticamente através da injecção robótico, reduzindo significativamente o tempo de injecção e permitindo alta reprodutibilidade da infecção por 7, 8. Trabalhos anteriores utilizando o peixe-zebra como um elevado rendimento no sistema de modelo in vivo para o estudo de S. epidermidis e M. infecção marinum mostrou-se bem-sucedido 7, 8. Este sistema é capaz de seleccionar para a progressão da doença por meio de injecção de gema robótico de embriões precoces e usando fluorescência de leitura como uma medida para a carga bacteriana. De acordo com esta noção, esta configuração foi optimizado e estabelecido um gasoduto de alto rendimento altamente eficiente, com o potencial para gerar grandes números de embriões infectados de forma homogénea e rastrear a evolução da infecção, durante o tempo após o tratamento com uma série de compostos. Com a configuração estabelecida, é possível gerar até 8.000 embriões sincronizadas para a telapara a progressão da doença, o tratamento desta forma até 2.500 embriões por hora. Os embriões são classificados com base na sua carga bacteriana utilizando um sistema automatizado, assegurando grupos homogéneos de larvas infectadas. Além disso, para validar a configuração, efeitos de referência conhecidos para evitar a progressão da tuberculose em mamíferos foram testados em embriões infectados com M. marinum E11 tensão ou o mais virulento M tensão 9. Este estudo descreve em pormenor o elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida a ser capaz de gerar um grande número de embriões infectados e a subsequente análise da progressão bacteriana durante o desenvolvimento e depois de tratamento com o composto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebrafish estão se tornando uma ferramenta valiosa na fase pré-clínica de exames de descoberta de drogas como um modelo animal inteiro com possibilidades de rastreio de elevada capacidade. Eles podem ser usados ​​para fazer a ponte entre os ensaios baseados em células em fases anteriores e na validação in vivo em modelos de mamíferos, reduzindo, desta forma, o número de compostos que passam através de testes sobre os modelos de roedores muito mais caros. A esta luz, no presente manuscrito é descrito um novo gasoduto de alto rendimento utilizando zebrafish como in vivo sistema modelo para o estudo de Staphylococcus epidermidis e infecção Mycobacterium marinum. Esta configuração permite a geração e análise de grande número de embriões sincronizadas homogeneamente infectado. Além disso, a flexibilidade da conduta permite ao utilizador aplicar facilmente outras plataformas de melhorar a resolução da análise, quando necessário. A combinação do peixe-zebra com elevado rendimento te inovadorchnologies abre o campo de teste de drogas e para a descoberta de novas possibilidades não só por causa da força da utilização de um modelo animal, mas também devido ao grande número de linhas transgénicas disponíveis que podem ser usadas para decifrar o modo de acção dos novos compostos.

Os resultados deste estudo mostram que o gasoduto de transferência de alta para estudar S. epidermidis e M. infecção marinum foi estabelecida com sucesso e que pode ser estendida a outros modelos de infecção. Em primeiro lugar, o uso de um grande vaso de criação (Figura 1A), com base no sistema publicada por Adatto et al. (2011) 11, permite a geração de grandes números de ovos síncronos em eventos individuais que proporcionam um elevado controlo do processo de desova. Em seguida ser capaz de injectar grande número de embriões num curto período de tempo, foi utilizada uma versão melhorada do sistema automatizado anteriormente desenvolvido micro-injecção 7 (Figura 1A). Para avaliar qual é a melhor fase de desenvolvimento para a infecção gema, injeções com S. epidermidis e M. marinum foram realizadas em todas as diferentes fases de entre 1 e 512 fase celular, de acordo com a descrição feita por Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Injeções com 100 ufc S. epidermidis entre a fase 16 e 128 células, desde que o melhor padrão de infecção (Figura 2). As bactérias proliferam no interior da gema por 3 dias e se espalhou para o corpo a partir de 3 dpi em diante. Realizando injecções antes da etapa de 16 células conduziu à elevada taxa de mortalidade de 4 dpi, e depois da fase de injecção de células 256 apresentaram crescimento bacteriano, principalmente no interior da gema com quase todas as bactérias propagação no interior do corpo do embrião. Quantificação da carga bacteriana foi realizada por análise de intensidade de fluorescência usando o fluxo de partícula grande citómetro como descrito por Veneman et al. (2013) 8 (Figura 3). As observações mostraram que o estádio de desenvolvimento ideal para a injecção de 30 CFU M. injecção marinum é entre 16 a 128 fase da célula para a estirpe E11 (Figura 4A) e entre 16-64 fase célula com o M strai mais virulenton (Figura 4B). Os embriões injectados nestas fases mostrou o crescimento bacteriano dentro da gema e propagação das bactérias através do embrião (figura 7). A infecção com ambas as cepas em fases anteriores apresentaram crescimento bacteriano generalizada inespecífica levando os embriões a morrer depois de 4 dpi. Por outro lado, em embriões injectados em fases posteriores da carga bacteriana foi restrita à gema. Em seguida, pré-triagem com grande partícula citometria de fluxo (Figura 1B) gerou grandes grupos homogéneos de peixes infectados excluindo embriões não-ou altamente infectados (figuras 5A e 6A). Depois de pré-ordenação M. embriões infectados marinum foram tratados com rifampicina, um fármaco de primeira linha anti-tuberculose. Estudos anteriores demonstraram que o tratamento com rifampicina numa dose de 200 uM reduz eficientemente M. marinum infecção em peixes-zebra 7, 13. Tomando advantage do grande número de embriões homogeneamente infectadas gerados com o elevado rendimento de configuração, o tratamento com doses diferentes foi realizada. Os embriões infectados com M. M marinum estirpe e tratados durante 48 horas com 12, 24, e 200 uM Rifampicina mostrou reduzir a infecção por micobactérias eficiente de uma forma dependente da dose (Figura 5B). Tendo em vista a redução eficiente da infecção utilizando rifampicina numa dose de 200 uM esta concentração foi usada para as futuras experiências. Em linha com o resultado anterior, estudando progressão carga bacteriana usando M. marinum E11 tensão uma redução significativa de 24 horas em diante após o tratamento com 200 mM Rifampicina foi observado (Figura 6B). Além disso, se a imagem de alta ampliação é necessária destes embriões, podem ser exibidos automaticamente em placas de 96 poços (Figura 1C), a partir dos quais as amostras podem ser analisadas usandoo sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler montado em um CLSM. O sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler é um sistema que pode ser montado em um CLSM ou microscópio estéreo. Este dispositivo permite o carregamento de embriões vivos ou fixas a partir de uma placa de 96 poços ou recipiente de volume automaticamente por meio de um capilar de vidro, e orienta-o em frente da câmara para o ângulo desejado (por exemplo, dorsais ou laterais). Imagens do embrião em todas as orientações podem ser feitos com a câmara na placa ou com um CLSM externa (Figura 7). Os embriões serão posteriormente transferidos na coleção ou resíduos recipiente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figura 1. Outl experimental Mainstreamine. A) peixes adultos são colocados juntos para acasalar, os ovos são recolhidos, alinhados em uma placa de agarose e injectado. B) Os ovos injectados são incubados a 28 ° C e irá ser pré-ordenada para possível tratamento da toxicodependência. C) A análise posterior por grande fluxo de partículas citômetro e / ou Grande Particle Sampler / Vertebrate Tecnologia Triagem Automatizada com CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figura 2. Estabelecimento de melhor estágio de célula para S. epidermidis gema injeção. embriões Zebrafish foram injetados na gema em diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 100 ufc de S. epidermidis. Embriões injetados entre 1 a8 ª etapa células apresentaram crescimento bacteriano na gema e elevada mortalidade de 4 dpi. Os embriões injectados entre 16 e 128 estágio celular mostraram crescimento bacteriano na gema e no interior do corpo a partir de 3 dpi. Embriões injetados entre fase 256 e 512 células mostraram muitos o crescimento bacteriano no interior da gema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figura 3. Quantificação da carga bacteriana usando o grande fluxo de partículas citômetro. 100 ufc de S. epidermidis foram injectadas na gema de embriões de peixes-zebra. D) até 5 dpi, cada dia, os grupos de 10 embriões foram homogeneizados e plaqueados directamente, mostrando o crescimento exponencial média, com base em duas réplicas biológicas (barras de erro= SEM). B) Grande fluxo de partículas citômetro análise mostra o sinal de fluorescência média de não-injetado e S. epidermidis injetado embriões. Foram analisados ​​30-160 embriões por condição (barras de erro = SEM), letras diferentes indicam diferença significativa pelo one way ANOVA seguido pelo teste de Tukey post-hoc (P &lt;0,001), ns:. Não diferenças significativas C) Correlação entre ufc e sinal de fluorescência média de 10 grupos de S. epidermidis infectado embriões (barras de erro = SEM). Este valor foi modificado a partir Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figura 4. Establishment da melhor fase da célula para M. marinum gema de injeção. embriões Zebrafish foram injetados em todos os diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 e M tensão. A, B) Embriões injetados 1-8 estágio de célula mostrou semelhante espalhando e mortalidade com as duas cepas. A) Embriões injetados entre 16-128 estágio de célula com E11 cepa mostrou formação de granulomas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetados 256-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema. B) Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com M cepa mostrou formação de granuloma como estruturas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetado 128-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo: Conteúdo-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Tratamento de M. infecção aguda marinum com uma primeira linha anti-tuberculose de drogas. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum M tensão foram executados através da partícula grande citômetro de fluxo em 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas. A) fluorescência de embriões individuais em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF ) durante 48 horas, em doses de 12, 24, e 200 ^ M foram analisados ​​em 4 dpi; a carga bacteriana é significativamente reduzida. C) Perfis COPAS representativos de embriões tratados com DMSO e rifampicina em doses de 12, 24, e 200 uM, durante 24 horas. Carga e distribuição de bactérias é indicada pelos picos vermelho. Linha azul representa o perfil do elemento classificado (4 dpf zebrafish embryo) pelos COPAS. Foram analisadas 60-90 embriões por condição. Cada ponto de dados representa um embrião individual. Os valores são indicados como média ± SEM. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey posthoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figura 6. Tratamento de M. infecção crônica marinum com uma primeira linha de drogas antituberculose. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 tensão foram executados através do grande fluxo de partículas citômetro de 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas.<html> A) A fluorescência de embriões individuais, em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF) a 200 uM durante 4 dias foram analisadas, mostrando uma redução significativa da carga bacteriana após 1 dia de tratamento. Foram analisados ​​90 embriões por condição. Os valores são indicados como média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre pontos de tempo do mesmo tratamento. * Indica diferenças significativas com o grupo controle. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido por teste post hoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figura B) tenha sido modificado a partir Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Resultado de M. marinum E11 injeção gema fotografada usando Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizada e CLSM. pilha Z confocal (costurado 3 imagens) de um 5 dpi FLI1-egfp 14 embrião. A) embrião vivo mostrando proliferação de M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo. B) Fixa 5 dpi fli-egfp embrião mostrando M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo co-localização com leucócitos (azul claro) detectada pelo L-plastin imunomarcação 15.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K visualizações.  Leiden University.  Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...