O financiamento foi fornecido pela NSF CCLI # 0633618 e da Universidade de Ohio. Algumas cepas foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center. Pós-graduanda Reetobrata Basu aparece no vídeo.

NOTA: Várias etapas do protocolo são apresentados com opções para set-up e preparação, dependendo das condições específicas de cada ensaio. Para estes casos, as etapas alternativas são apresentados como A, B, C, etc O protocolo com passos alternativos é descrito na Figura 1. 1. Preparação de Slides Polilisina revestidos Podem ser utilizados três tipos diferentes de lâminas, dependendo da troca desejada entre a facilidade de preparação, a adesão relativa, e a ligação não específica do anticorpo. Detalhes das alternativas de preparação de diapositivos são apresentados abaixo nas etapas 1A-1C, a fim de aumentar a aderência e complexidade. Lâminas preparadas por estes métodos diferentes podem ser usados ​​em conjunto para uma única experiência. 1A. Sem preparação da lâmina Polilisina revestido lâminas comercialmente disponíveis fornecem baixa adesão e baixo de fundo. 1B. Deslize preparation óptima para a fixação de metanol-acetona Adesão médio e baixo de fundo. <ol><li> Prepara-se uma solução de polilisina por imersão das lâminas: Adicionar 400 mg de peso molecular muito elevado (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina a 200 ml de água bidestilada. Adicionar 2 ml de 10% de estoque de azida de sódio (concentração final 0,1%) como conservante. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao pó de pesagem para fazer 10% de ações em água bidestilada. </li><li> Limpe finais único lâminas de vidro fosco com toalhetes sem fiapos, removendo manchas e partículas. Isto deve ser feito mesmo em lâminas comprados com a designação &quot;previamente limpas.&quot; </li><li> Colocar as lâminas back-to-back em um suporte de slide, jar coplin ou outro recipiente coloração slide, mantendo bordas foscas e não muito perfeitamente alinhados (para fazer a separação depois mais fácil). Colocar o suporte fatia na proveta com 70% de etanol (álcool de grau de reagente não é necessário) com HCl a 1% em diágua acalmou ou preencher tina de coloração para o nível de cobertura. Rocha lâminas em solução de um mínimo de 5 minutos. ATENÇÃO: Esta solução é corrosiva, usar luvas. NOTA: Esta solução pode ser reutilizado várias vezes (até vários meses). </li><li> Lavar as lâminas em água corrente destilada por 1 min. </li><li> Lâminas secar completamente em um ambiente livre de poeira ou por colocação em um forno de 40-60 ° C durante 30-60 min ou por se manter durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as lâminas em solução polilisina (cobrindo partes unfrosted) no balancim para 15 min. </li><li> Repetir a secagem das lâminas. </li><li> Repita polilisina solução de incubação e as etapas de secagem. </li><li> Separe os slides usando um objeto de metal fino, como uma espátula fina de peso. Se forem devidamente respeitados, eles são difíceis de separar. Usar equipamento de segurança adequado (óculos de segurança) e trabalhar no banco de papel superior (para ser descartado após o uso), desde pequenos pedaços de vidro pode voar solta quando lâminas são separadas. </li><li> Armazenar slides em limpoCaixa (livre de poeira) slides a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> 1C. Deslize a preparação ideal para a fixação em formol Maior adesão, mas de alta fundo. <ol><li> Colocar as lâminas preparadas com método 1B plana e em um forno-safe livre de poeira (para a secagem no forno) ou em uma superfície plana livre de poeira (para secagem do ar). </li><li> Colocar uma gota de 20-60 ul da solução de polilisina no meio de cada lâmina. </li><li> Lâminas secar completamente em forno ou em temperatura ambiente. A polilisina vai deixar para trás ovais pálidos como se evapora. Estes ovais são muito adesivas. Infelizmente, eles também se ligam aos anticorpos primário e secundário, até mesmo após o bloqueio. </li><li> Armazenar slides em limpar caixa de slides (livre de poeira) a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> 2. Preparação de congelados Nematode Slides Prepare nematóides para coloração por enxaguar completamente livre de bactérias através do método 2A (para placas de nematóides) ou2B (para nemátodos individuais). 2A. Preparação de slides de placas de nematóides <ol><li> Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para prechill. </li><li> Use água destilada e uma pipeta de vidro (diminui a perda de vermes) ou micropipeta para enxaguar worms de placa NGM com bactérias em um microtubo de 1,5 ml. As placas podem ser sincronizados ou misturado as idades, não use placas com muitos dauers (difíceis de roer) ou vermes esfomeados (aumento da autofluorescência) a menos que necessário. </li><li> Lave os vermes 3-4x com água destilada até livre de bactérias. (Para diminuir a perda de vermes usar a mesma pipeta de vidro.) Para agregar vermes, ou deixá-los sentar-se no banco para 3-5 min (para coletar principalmente adultos do fundo do tubo) ou spin 30 segundos a ~ 1.000 rpm (~ 500 g) em uma centrífuga de mesa (para coletar adultos, larva e embriões). </li><li> Remover a maior parte da água do tubo de vermes, deixando cerca de duas vezes o volume de água como vermes (mas o volume total de, pelo menos, 25 ul). </li><li&gt; Etiqueta lado fosco do &quot;bottom&quot; (tratado no passo 1) lâminas de polilisina com tinta e colocar as lâminas indeléveis no contador ao lado de recipiente com gelo seco, com a etiqueta para cima. </li><li> Tenha um número igual de regulares (limpo, mas não tratados polilisina) slides &quot;top&quot; disponíveis. </li><li> Lugar ~ 25 ul vermes na água no &quot;fundo&quot; de slides aderente e espalham o líquido contendo os vermes sobre a parte central do slide usando o lado do ponta da pipeta. </li><li> Deixe que os vermes se contentar com 30 seg a 2 min. Se o slide é adequadamente pegajoso, as extremidades dos vermes vai ficar como eles em contato com o slide. </li><li> Segure a lâmina inferior em uma mão e coloque a parte superior de slides sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos. O líquido deve manter as lâminas ligeiramente afastadas, de modo que os vermes ainda mover-se ligeiramente Não deixe que as lâminas deslizam uns sobre os outros -. Este torce os vermes. </li><li> Cuidadosamente pressione para baixo slevemente no topo slide, usando os polegares e indicadores de cada mão. Com a quantidade ideal de pressão, alguns dos maiores hermafroditas na borda dos slides irá romper, enquanto a maioria dos adultos e larvas entrará em contato com cada slide, mas vai permanecer intacta. </li><li> Imediatamente e com cuidado (sem escorregar) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Os slides devem aparecer congelado dentro de um minuto. Manter em gelo seco por 5 minutos até ficar bem gelado. </li><li> Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas numa caixa marcado a -80 ° C durante vários dias. (Se forem mantidos semanas a -80 ° C, a água começa a sublimar distância e os vermes não mancha bem). Se as lâminas são armazenadas a -80 ° C, deixe-os &#39;aquecer&#39; em gelo seco por 10 min antes de rachar. </li><li> Vá para a etapa 3 (fixação). </li></ol> 2B. Preparação de lâminas de nematóides individuais <ol><li> Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para PRECcolina. </li><li> Use uma pick verme para transferir nematóides individuais para uma gota de água sobre uma placa NGM para libertá-los a partir de bactérias. Nematóide (s) deve ser bem alimentado para diminuir autofluorescência, se possível. Repita a transferência para novos pontos de água, conforme necessário, até verme (s) estão livres de bactérias. </li><li> Rotular lado fosco dos &quot;de baixo&quot; slides de polilisina com tinta e colocar as lâminas indeléveis no contador ao lado de recipiente com gelo seco, com a etiqueta para cima. Ter um número igual de menos aderente &quot;top&quot; (não tratadas) desliza disponíveis. </li><li> Coloque uma gota mL 5-10 de água na região da lâmina inferior tratado duplo com polilisina. Use o volume maior se transferir mais vermes, para evitar que a água evapore antes da conclusão. </li><li> Transfira o worm (s) para a gota de água com a pick verme, usando o microscópio para ver como os vermes afundar para tocar a superfície da lâmina pegajosa. Transferir tão poucos como um verme para até 20 + vermes por gota. </li><li> Segure o S fundolide com uma mão e coloque o topo deslizar sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos. </li><li> Imediatamente e com cuidado (sem escorregar ou comprimir) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Manter em gelo seco para 5-30 min. (Não guarde esses slides longo prazo, como os slides seca facilmente para fora.) </li><li> Vá para a etapa 3 (fixação). </li></ol> 3. Fixação Fixadores são necessárias para &quot;consertar&quot; o antígeno no local na célula, por um ou outro precipitante (&quot;fixação de luz&quot;) ou de ligação cruzada (&quot;fixação duro&quot;) o antígeno. Fixação pode perturbar antigenicidade; anticorpos mais conhecidas funcionam melhor com uma condição fixação particular. Para os novos anticorpos, uma gama de condições de fixação deve ser testado. Para qualquer mecanismo de fixação, o primeiro passo é o de preparar uma solução salina tamponada com fosfato. Próxima dose slides com nematóides para coloração de anticorpos usando o método A (luzcorrigir usando metanol e acetona) ou B (correção mais difícil usando formaldeído ou glutaraldeído). <ol><li> Prepara-se uma solução 10x PBS (tampão fosfato salino) estoque estéril por adição de 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 27,2 g de Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g de KH 2 PO 4, estoque de azida de sódio a 20 ml de 10%. Para fazer com que esta solução de estoque, pesam-se azida de sódio em pó para fazer uma solução a 10% em água destilada duas vezes. Mexa salina com calor suave até dissolver. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao trabalhar com azida de sódio seco ou soluções. </li><li> Deixe arrefecer salino (Tris pH é sensível à temperatura), em seguida o pH para 7,2 com NaOH 1-10 H. Top para 1 L com água bidestilada e autoclave para esterilizar. Conservar à temperatura ambiente e diluir a 1x, conforme necessário, com água duplamente destilada estéril. CUIDADO: NaOH é cáustico - use luvas durante o uso. </li></ol> 3A. Correção de luz usando metanol-acetona <ol><li> Coloque 100% de metanol, 100% de acetona, e 1 x tampão fosfato salino (PBS), em frascos de coloração em gelo para prechill durante pelo menos 10 min. CUIDADO: O metanol e acetona são tóxicos, use luvas. </li><li> Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e imediatamente mergulhe o slide &quot;fundo&quot; no gelo metanol frio por 2 min. O slide &quot;top&quot; pode ser descartado. </li><li> Transferência de slides de metanol para acetona gelada por 4 min. Se os slides tinha muitos vermes, a maioria (90%) vai cair na correção, mesmo com os slides melhor preparados. Se desliza sem-fim único foram devidamente preparados, os vermes deve ficar aderido. </li><li> Coloque ou mergulhar as lâminas na jarra com PBS (para enxaguar fixador) e vá para a etapa 4 (coloração). </li></ol> 3B. Correção rígido usando formaldeído ou glutaraldeído <ol><li> Diluir reagente formaldeído grau ou solução de glutaraldeído em 1x PBS para 0,5-4% de concentração final. Alíquotas (1,5 ml) may ser armazenados bem tapado a -20 a -30 ° C; descongelar alíquotas em gelo imediatamente antes da utilização. NOTA: As soluções de formaldeído degradar ao longo do tempo e com a exposição ao ar. CUIDADO: formol e glutaraldeído são tóxicos, usar luvas e trabalhar no bairro. </li><li> Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e colocar imediatamente o slide &quot;fundo&quot; com vermes no prato raso com tampa. (A corrediça de topo pode ser descartado). </li><li> Imediatamente pipeta 200 uL fixador tóxico sobre o centro da área da corrediça com vermes. O fixador será parcialmente congelar no lugar, então derreter para cobrir uma região maior do slide. </li><li> Se os vermes não são totalmente cobertos com fixador, adicione imediatamente e com cuidado mais fixador usando uma micropipeta. Não permita que o fixador para fluir ao longo da borda do slide. </li><li> Cobrir a placa com uma tampa e deixar durante 10 minutos a durante a noite à temperatura ambiente. Certifique-se o prato é umidificado se incubações mais are usado - isso pode ser feito através da adição de toalhetes sem fiapos molhadas dobradas para o prato. Não deixe que os toalhetes tocar nos slides. </li><li> Após a fixação estiver concluída, pipetar cuidadosamente o fixador com vermes soltas em um tubo de 1,5 ml e mergulhar o slide em uma tina de coloração com PBS. </li><li> Gire o tubo com vermes que vieram soltos em alta velocidade por 30 segundos para sedimentar. Lave os vermes duas vezes com PBS, em seguida, processar em paralelo com os vermes nos slides (fazendo passos em tubos de microcentrífuga, em vez de em lâminas). </li><li> Vá para a etapa 4 (coloração). </li></ol> 4. Anticorpo de coloração O protocolo de coloração de anticorpo é semelhante para os protocolos padrão para qualquer tecido em lâminas. Este protocolo é o mesmo para todas as lâminas, independentemente de a preparação em passos 1-3. <ol><li> Preparar tampão de anticorpo através da mistura de 700 ml de água destilada duas vezes, com 100 ml de PBS 10x, 5 mL de Triton X-100 (0,5% final), 2 ml de EDTA 0,5 M pH 8 (1 mM final), 1 g de BSA (0,1% final), az sódio 5 ml de 10%solução ide (0,05% final). pH para 7,2 com HCl, em seguida, adicione água bidestilada para 1 L; armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare bloco por soro de burro a reconstituição com água bidestilada, em seguida, a adição de 5 ml de soro de 45 ml de tampão de anticorpo (soro final de 10%). </li><li> Preparar soluções de anticorpos primários e secundários diluindo anticorpo em tampão anticorpo mais 1% BSA. Diluições recomendadas são 1:50-1:2,000 de anticorpos primários e 1:1,000-1:5,000 para anticorpos secundários (anticorpos de burro conjugado Cy3or OG488 contra as espécies usadas para aumentar o anticorpo primário). </li><li> Prepare estoque DAPI misturando 2,5 mg / ml em água bidestilada; loja em 8 mL alíquotas congeladas a -30 ° C. CUIDADO: DAPI é um corante de ligação DNA tóxico, usar luvas durante a pesagem e distribuição em alíquotas. </li><li> Preparar 10 ml de Meio de Montagem, misturando 200 mg de galato de n-propilo, 0,3 ml de Tris 1 M pH 9, 2,7 mL de água bi-destilada num tubo de 15 ml. Aquece-se a 65 ° C durante cerca de 10 minutos até dissolver.Adicionar 7 ml de glicerol e uma alíquota de 8 mL de DAPI e vórtice bem. Médio Alíquota em tubos de 1,5 ml, embrulhe em papel alumínio, e guarde em luz, a 4 ° C (ar e luz degradar o meio - se torna-se mais amarela, descarte no lixo Biohazard). CUIDADO: n-propil galato é um anti-oxidante reativo, usar luvas durante a pesagem. </li><li> Transferir as lâminas para uma tina de coloração com o Bloco por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C (overnight preferível para correção difícil). Evite agitação para evitar a perda de worms. </li><li> Transferir as lâminas para coloração frasco com anticorpo primário ou colocar as lâminas planas em um prato umedecido e cubra cada uma com 100-500 anticorpo primário mL. Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C sem agitação. </li><li> Depois de anticorpo primário incubação, transferência desliza a manchas frasco de PBS. </li><li> Filtro de bloco através de funil forrado com papel de filtro e armazenar a 4 ° C; se estéreis filtradas cada 1-2 semanas, Bloco pode ser reutilizado para um ou mais meses. Da mesma forma, filtrar e salvaranticorpo primário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração). </li><li> Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo. </li><li> Colocar as lâminas em anticorpo secundário de coloração num recipiente à prova de luz e incubar 4 horas a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Transferir as lâminas para coloração frasco de PBS. Filtro e salvar anticorpo secundário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração). </li><li> Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo. </li><li> Transferir as lâminas para PBS e deixar em PBS (minutos a durante a noite a 4 ° C) até que esteja pronto para montagem. </li><li> Trabalhar rapidamente em slides individuais, de modo que os vermes na frente de slides ficar molhado. Remover uma lâmina da PBS, secar parte de trás da lâmina com uma limpeza sem fiapos, e coloque sobre toalha de papel. </li><li> Lugar ~ 20 l de meio de montagem sobre vermes para que não haja partes aproximadamente iguais médio e PBS em slides e inclinação deslize suavemente para misturar as duas soluções. CAUTION: Meio de montagem é tóxico. </li><li> Tilt slides borda assim fosco é mais baixo e solução reúne perto de geada, em seguida, coloque uma borda de 24 x 60 mm lamela em solução. </li><li> Abaixe cuidadosamente a lamela para minimizar bolhas de ar (que aumentam branqueamento e atrapalhar a visualização). Se formar bolhas, levantar a extremidade da lamela lentamente, em seguida, relower sem deslizamento da lamela entre os vermes. </li><li> Secar cuidadosamente a borda do slide sem mover a lamela, comprimindo as bordas com uma limpeza sem fiapos. A vantagem relativamente seco da lâmina tem de ser visível ao redor da extremidade da lamela </li><li> Selar a lamela com 2-3 camadas de unha polonês. Slides podem ser colocados em um suporte de slides plana durante a preparação e armazenamento para proteger da luz. Uma vez slide é bem fechado e seco, limpe a lamela e de trás do slide. </li><li> Desliza bem fechados podem ser mantidos no escuro durante dias a 4 ° C ou semanas à temperatura de -20 ° C. Durante longos períodos, DAPI staining de DNA ea maioria dos corantes verdes (por exemplo, 488 nm de excitação) fade. Selar a lamela com mais unha polonês, conforme necessário, por exemplo, após o uso de qualquer lente de imersão em óleo. </li></ol>

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O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

O protocolo de congelamento de craqueamento é um dos vários métodos para a coloração do anticorpo em C. elegans. Ele fornece uma maneira relativamente simples de manchar vermes, mas exige reagentes específicos e prática para os melhores resultados. As etapas críticas (esboçado na Figura 1) incluem: 1) preparação de slides (consulte as etapas 1 e 2) de compressão manual dos nematóides (veja as etapas 2 e 3) de fixação rápida (ver passo 3). Em primeiro lugar, para maximizar a ades...

Para determinar a localização celular e subcelular de proteínas, os cientistas têm tradicionalmente marcado tecidos com anticorpos seleccionadas para reconhecer especificamente um especial proteínas. Em alguns organismos modelo, como C. elegans, coloração do anticorpo foi frequentemente substituído por técnicas de genética molecular, que produzem resultados mais rapidamente. Estes incluem a transformação de organismos com construções que consistem de fusões de genes entre as regiões de codificação do gene de interesse e proteína fluorescente verde e promotor. No entanto, as técnicas moleculares estão sujeitas a um número de artefactos, incluindo problemas com a saber o verdadeiro promotor e alterações na expressão de construções no número de cópias alto (as técnicas usuais em C. elegans) 2,3. Portanto, a coloração com anticorpos continua a ser uma meta para muitos cientistas que estudam a função da proteína in vivo. A coloração de tecidos com anticorpos pode ser difícil, uma vez que umtibodies só pode reconhecer o seu antígeno em uma determinada conformação 1. Por exemplo, os anticorpos podem reconhecer apenas antígeno desnaturado ou intacto fixo de uma maneira particular e pode não reconhecer o antígeno in situ. O problema de coloração do anticorpo em nemátodos é exacerbado pelo facto de a cutícula do nemátodo forma uma barreira relativamente impermeável, impedindo o acesso dos anticorpos aos tecidos. Existem vários métodos diferentes usados ​​para a coloração do anticorpo em C. elegans (revisado em nosso trabalho anterior 4). Para manchar intactas &#39;vermes&#39;, métodos foram desenvolvidos para congelar e descongelar em um fixador relativamente duro (formaldeído ou glutaraldeído), os ciclos de congelamento e descongelamento ajudar a quebrar a cutícula para permitir a rápida penetração do fixador 5. Após a fixação, a cutícula foi permeabilizadas para permitir a penetração do anticorpo; métodos incluído o tratamento com agentes, colagenase, ou ambos 5-7 redução. Estes treatments preservada morfologia, mas o reconhecimento de anticorpos frequentemente reduzido ou destruído. Os métodos alternativos incluem a dissecção 8 para permitir a penetração do anticorpo. &quot;Freeze-cracking&quot; é um meio de ganhar acesso ao interior do semi-sem-fim para permitir que o anticorpo intacto de coloração 9-10. Congela-craqueamento pode ser realizada com uma variedade de condições de fixação, evitando tratamentos de colagenase e de redução. Os nemátodos são colocados entre duas lâminas de adesivos, congelado, e, em seguida, as lâminas são separadas, deixando a maior parte do nemátodo na lâmina inferior e a maior parte da cutícula na corrediça superior. A corrediça inferior pode ser colocado em fixador e toda a lâmina com nemátodos aderidas é transferida através do procedimento de coloração do anticorpo. O método não apresenta duas grandes dificuldades. Primeiro, é difícil de aplicar a quantidade correcta de pressão necessária para dividir os nematóides, sem comprometer seriamente deformando-as. Em segundo lugar, muitos dos vermes não vai sassinale a qualquer slide, e serão perdidas no fixador ou lavagens. No entanto, com as lâminas e práticas adequadas, o método irá produzir rapidamente os nemátodos com morfologia razoável que pode ser usado com uma grande variedade de fixadores e anticorpos. O método pode ser ligeiramente variada, dependendo do objetivo do experimentador. Se a coloração de nemátodos individuais se desejado (por exemplo, para determinar se um único transformante alterou coloração do anticorpo) e, em seguida desliza com adesão máxima (mas maior fundo de coloração) pode ser utilizado, tais como lâminas, obtidos em laboratório com polilisina adicional (ver abaixo). Para formaldeído ou glutaraldeído fixação, lâminas de adesão mais elevados (slides de polilisina preparado em laboratório) devem ser utilizados, uma vez que nematóides aderir mais mal ao polilisina depois dessas fixações. Se tipo selvagem nemátodos estão fixadas com metanol e / ou de acetona, em seguida desliza para baixo com a adesão e menor coloração de fundo deve ser utilizada (comercial ou llâminas aboratory preparado). Se uma variedade de anticorpos e fixadores estão a ser utilizados em laboratório, uma variedade de lâminas podem ser preparadas com antecedência e guardadas até serem necessários. Após o acesso ao tecido nematóide foi adquirida, procedimentos de coloração de anticorpos seguir métodos padrão (com incubações mais característicos de tecidos em vez de células 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Para manchar C. elegans com anticorpos, a cutícula relativamente impermeável deve ser contornado por métodos químicos ou mecânicos. &quot;Freeze-cracking&quot; é um método usado para puxar fisicamente a cutícula de nematóides comprimindo nematóides entre duas lâminas de aderentes, congelá-los, e puxando os slides separados. Congela-craqueamento proporciona uma maneira simples e rápida para obter acesso aos tecidos sem tratamento químico e pode ser utilizado com uma variedade de fixadores. No entanto, isso conduz a uma perda de muitas das amostras e a compressão necessária distorce mecanicamente a amostra. Prática é necessária para maximizar a recuperação de amostras com boa morfologia. Congela-craqueamento pode ser optimizado para as condições específicas de fixação, a recuperação de amostras, ou a coloração não específica baixos, mas não para todos os parâmetros de uma vez. Para anticorpos que requerem condições de fixação muito rígidos e tolerar os tratamentos químicos necessários para permeabilizar quimicamente a cutícula, tratamentt de nemátodos intactas em solução pode ser preferida. Se o anticorpo requer uma posição mais clara ou se as condições de fixação ideais são desconhecidas, congelar-cracking fornece uma maneira muito útil para analisar rapidamente o anticorpo e pode render informações específicas localização subcelular e celular para o antígeno de interesse.

Quando worms são devidamente compactado, rachado, e levemente fixo, praticamente todo o worm pode ser acessível a coloração de anticorpos (ver Figura 2). A localização dos núcleos, tal como indicado por coloração com DAPI indica quais as partes do sem-fim está intacto Quando os vermes são submetidos a um fixador mais difícil, tal como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida (como pode ser visto pela aparência não natural ondulada do músculos nas Figuras 3A-D).<...

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Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Freeze-cracking&quot;, um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.5K visualizações.  Ohio University.  "Freeze-cracking", um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada. 

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinar perfis de expressão genética em C. elegans Usando Microarray e PCR em tempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...