Este protocolo é significativo, pois permite identificar a interação planta-fungo. Além de colorir a pectina, também demonstra defeitos no polímero da parede celular do patógeno e permite a identificação de estruturas de fungos. Esta técnica simples e descomplicada pode ser realizada usando microscopia leve e não requer nenhum equipamento caro, como o microscópio eletrônico de varredura.
Além disso, é uma técnica rápida que obtém uma excelente distinção de estruturas vegetais para estudos histopatológicos. A técnica identifica a interação planta-fungo. Assim, colabora para o diagnóstico das doenças causadas por fungos biotróficos e necrotróficos, como ferrugem do café e cercosporiose.
Para começar, colher e aproximadamente 10 milímetros quadrados de amostra de folha na região média da lesão usando um bisturi e pinça, e imergi-lo em 30 mililitros de solução fixa de Karnovsky. Sujeitar a amostra de folha a um baixo vácuo de 500 a 600 milibar por 15 minutos usando uma bomba de óleo, pelo menos quatro vezes para aumentar a permeabilidade da solução fixativa no tecido da folha. Após a fixação, lave a amostra da folha três vezes em tampão de cacodilato de 0,5 M diluído em água destilada por cinco minutos cada, e depois transfira para uma série etanolica classificada por 15 minutos em cada concentração de etanol.
Para transferir gradualmente as amostras para o metacrilato glicol, faça a Solução A misturando um grama de pó de metacrilato glicol com 100 mililitros de resina básica sob agitação magnética. Em seguida, mergulhe as amostras na proporção um a dois da Solução A e 100% etanol por três horas. Mergulhe as amostras na proporção de um a um para a solução A:100% etanol por três horas, depois imerso em uma resina básica pura por dois a quatro dias.
Sujeito a amostra a um vácuo baixo pelo menos quatro vezes ao dia durante 15 minutos, seguido de rotação. Misture 15 mililitros de Solução A com um mililitro do endurecedor em um béquer com rotação por dois minutos para produzir a solução de polimerização B.Coloque 1,2 mililitros desta solução de polimerização B em moldes plásticos. Usando uma picareta de madeira, transfira as amostras de folhas lesionadas da resina básica pura para a Solução B e evite o uso de pinças, pois elas podem causar esmagamento de tecidos.
Certifique-se de orientar rapidamente amostras de folhas perpendiculares aos moldes plásticos à medida que a solução B rapidamente se torna viscosa. Quando a orientação perpendicular das amostras da folha for alcançada, espere por 30 minutos e, em seguida, transfira o molde plástico para uma câmara de plástico ou vidro contendo gel de sílica para evitar a umidade. Uma vez que a resina e a amostra da folha sejam polimerizadas após duas a três horas, retire o bloco resultante do molde de plástico lixando a base do bloco com um arquivo de lixamento.
Em seguida, cole o bloco em um pedaço de madeira. Corte o bloco em seções de cinco micrômetros de espessura usando um microtómeo rotativo equipado com lâminas de aço de oito centímetros. Coloque as seções em lâminas de vidro cobertas com água destilada.
Em seguida, transfira os slides para uma placa quente para secar a 40 graus Celsius e promover a adesão das seções aos slides de vidro. Após a secagem, rotule os slides de vidro com o nome de referência do bloco e o número do slide. Cubra as seções com dois mililitros de 5% de algodão azul em lactofenol e aqueça-as em uma placa quente a 45 graus Celsius por cinco minutos.
Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada. Manche-o com dois mililitros de 0,01% vermelho rutênio na água por um minuto. Remova o excesso de corante lavando o slide três vezes em um béquer cheio de água destilada.
Coloque uma gota de água destilada sobre as seções e cubra as seções com um deslizamento de cobertura para a realização de análise de microscopia leve. No método de coloração dupla, Hemileia vastatrix hyphae contendo paredes celulares e o denso teor de protoplastos apareceu azul escuro em parenchyma esponjoso e palisade. A célula-mãe do haustorium e a haustoria também exibiram uma cor azul escuro.
O contador mancha com vermelho rutênio claramente definiu a distribuição fúngica nos espaços intercelulares. Durante a interação, hemileia vastatrix haustorium célula mãe quebrou a parede celular hospedeira e desenvolveu um pescoço haustorial cercado por compostos pecáticos. O encapsulamento cor-de-rosa-vermelho-rosa rico em pectina do pescoço haustorial não pode impedir a formação haustorial.
Em alguns casos, o encapsulamento rico em pectina envolveu o haustorium incompletamente. E em alguns casos, o haustorium está totalmente encapsulado. A parede celular rica em pectina mantém a integridade na borda da lesão, onde o fungo não está presente.
O método de coloração dupla demonstrou a presença de hifas intercelulares. Nas zonas de interação, as paredes celulares pectina pareciam perder sua integridade devido à dissolução. Estruturas reprodutivas como conidia foram encontradas na epiderme adaxial.
A higefa de cercospora coffeicola foi encontrada na câmara substomática como estruturas de curling, e o parênquima palisade na região da lesão parece ser submetido à lise de parede celular. Evite usar pinças, pois elas podem causar esmagamento de tecidos. Outros estudos histopatológicos sobre ferrugem, antracnose, cercosporiose, omuts e outras interações biotopróficas, hemibiotróficas e necrotróficas de plantas-fúngicas devem ser realizados para investigar o uso potencial dessa técnica em diferentes sistemas.
