Os autores agradecem aos criadores e à sociedade Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, França) pelo fornecimento de ovos fertilizados. Este estudo foi realizado sob os auspícios do consórcio de pesquisa APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), financiado pelo Centro Région Val de Loire, na França.

Os procedimentos de cuidado animal foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (86/609/CEE) e pelas regulamentações francesas sobre experimentação animal.
1. Preparação do isolador
<ol><li>Insira os materiais necessários em um isolador rígido sob pressão positiva: tubos de 50 mL, pipetas plásticas de 5, 10 e 25 mL, ração irradiada, água autoclavada e recipientes plásticos selados estéreis.</li>
	<li>Encha a armadilha germicidal de transferência com uma solução de amônio quaternário de 2%.</li>
	<li>Esterilize o isolador três vezes com vapor de formaldeído usando 60 mL de formalina (24% de formaldeído) adicionado a 30 g de permangante de potássio por metro cúbico (m3). Mova os materiais dentro do isolador entre cada esterilização para garantir a esterilização de todas as superfícies de contato.</li>
	<li>Coloque a temperatura isoladara para 37 °C por pelo menos 2 dias antes de introduzir os ovos. Coloque o higrômetro em 65-70% de umidade relativa (RH) no dia da introdução.</li>
</ol>2. Coleta e incubação de ovos
<ol><li>Recolher os ovos das fazendas selecionadas com base em uma boa taxa de eclosão das galinhas poedeiras (pelo menos 80% no pico da produção de ovos) e seu bom estado sanitário (ou seja, ausência de patógenos de aves comuns e ausência de doenças dentro do rebanho). Selecione visualmente ovos limpos e impecáveis na esteira.</li>
	<li>Descontamine imediatamente a superfície do ovo mergulhando-as por 5 minutos em uma solução de ácido peracético de 1,5% à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transporte os ovos para a instalação experimental usando uma caixa descontaminada com vapor formaldeído.</li>
	<li>Guarde os ovos por 24 horas a 4 °C. Repita o processo de descontaminação descrito na etapa 2.2 e coloque-os em uma incubadora de incubação (Dia 0) por 19 dias.</li>
</ol>3. Incubação
<ol><li>No dia 19, verifique a fertilidade, a viabilidade (motilidade) e o desenvolvimento do embrião, usando um candler de ovo leve em condições estéreis. Introduza apenas ovos embriados vivos nos isoladores estéreis de eclosão.</li>
	<li>Descontamine os ovos selecionados pulverizando 1,5% de solução de ácido peracético para 30 s ou até que toda a superfície de cada ovo esteja coberta. Os ovos permanecerão em contato com o spray por 16 minutos e 30 s durante a transferência para isoladores.</li>
	<li>Transfira os ovos para os isoladores estéreis de eclosão e enxágue-os com água desmineralizada estéril antes de colocá-los no espaço de eclosão. NOTA: Os animais são eclodidos e criados em isoladores estéreis. Eles são alimentados com ad libitum com uma dieta comercial esterilizada pela irradiação gama e regada com água da torneira autoclavada fornecida por distribuidores de água.</li>
</ol>4. Análise do estado bacteriológico
<ol><li>Um dia após a eclosão, pegue uma amostra fecal diretamente do reto de diferentes filhotes e acumule-os em um tubo de vidro esterilizado, a fim de tornar esta amostra representativa de todos os animais dentro de um determinado isolador.</li>
	<li>As amostras fecais sendo mais ou menos líquidas, adicionam um equivalente de 1 mL de fezes a 9 mL de caldo de tioglicolato com resazurina. Adicione a amostra fecal restante a 9 mL de caldo de infusão do coração cerebral (BHI) e incubar os tubos a 37 °C sem tremer por 18 a 48 h. Isso permitirá o crescimento de uma ampla gama de espécies aeróbicas aeróbicas, facultativas e não versíbicas. NOTA: O caldo de tiaglicolato com resazurina destina-se à detecção de bactérias anaeróbicas não versíduas, mas também permite a detecção de bactérias aeróbicas. Este meio está em conformidade com as farmacocopoias europeias, americanas e japonesas para testes de esterilidade 18,19,20.</li>
	<li>Observe visualmente se alguma modificação na mídia de crescimento ocorre após 18 horas de incubação. Depois de 48 h, pegue uma gota da mídia de caldo fecal bhi, coloque-o em um slide de vidro e observe sob um microscópio (ampliação 40X) para a ausência ou presença de bactérias.</li>
	<li>Se houver suspeita sobre a presença de bactérias, pegue uma amostra da cultura BHI e semee-a em placas de ágar BHI. Incubar a 37 °C por 18 a 48 h.</li>
	<li>Se as colônias estiverem presentes, realize técnicas de alta produtividade, como espectrometria de massa MALDI-TOF para identificação microbiana precisa. NOTA: Após 72 h, se as análises bacteriológicas forem negativas, os animais são declarados livres de germes.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Vários métodos para gerar galinhas sem germes foram descritos anteriormente 7,21,22. Métodos simples, como o apresentado aqui, utilizam diferentes desinfetantes para reduzir a carga bacteriana na superfície do ovo e nos isoladores. Os desinfetantes mais usados são cloreto mercurico, amônio quaternário, iodoforme, hipoclorito de sódio e soluções de dióxido de cloro. Os resultados são muitas vezes satisfatórios. No entanto, apesar da acessibilidade desses métodos, poucas estruturas podem aplicar o método e criar os animais em larga escala, tornando a utilização de frangos livres de germes uma abordagem relativamente rara, usada apenas para abordar questões científicas muito específicas. Os métodos, materiais e equipamentos descritos aqui permitem uma proporção de eclosão altamente eficiente de frangos sem germes, que permanecem saudáveis e estéreis por pelo menos 3 semanas (a duração dos experimentos científicos aos quais foram produzidos).
Os resultados mostram que a adaptação do protocolo à produção de filhotes livres de germes a partir de ovos coletados em granjas comerciais de aves é bem sucedida. A experiência com a produção de ovos spf revela que a eficiência do eclosão depende principalmente da idade das galinhas poedeiras e da qualidade dos ovos coletados. Ambos os parâmetros foram levados em consideração quando as fazendas foram escolhidas e os ovos coletados. Usando o mesmo método, a taxa média de eclosão de frangos sem germes é muito melhor do que a obtida na última produção de galinhas poedeiras spf em nossa instalação (79% vs 35%), sem afetar a esterilidade animal (87% vs 83%). Essas diferenças podem estar associadas ao contexto genético das aves (frangos de corte versus camadas) bem como à qualidade da casca de ovo, que provavelmente será mais frágil nos ovos dos animais da FPS, mantidos em reprodução fechada por mais de 40 anos. Além disso, também mostramos que o transporte de mais de 2h (das fazendas até a instalação experimental) não afeta a eficiência e a qualidade do eclosão.
Embora o processo de esterilização utilizado para isoladores de eclosão e o protocolo de descontaminação de ovos tenham sido otimizados, cerca de 10% dos isoladores não estavam livres de germes. Para entender a origem da contaminação, é muito importante realizar o controle de esterilização de rotina dos isoladores eclodidos antes da introdução do ovo.
Quanto ao estado de esterilidade das aves, tentamos aplicar métodos que permitem o crescimento de bactérias anaeróbicas aeróbicas e não versíbicas a partir de amostras fecais, garantindo assim que estamos detectando bactérias vivas e viáveis. Esses métodos estão em conformidade com as farmacopeias internacionais para testes de esterilidade e representam técnicas rápidas, fáceis e reduzidas de custos para serem usadas rotineiramente. No entanto, técnicas de biologia molecular, como o sequenciamento genético de rRNA 16S, embora não fornecendo informações sobre viabilidade de bactérias, podem ser aplicadas para a confirmação da presença de bactérias nãocultivais. De fato, um estudo recente sugeriu que algumas bactérias da microbiota oviduto materno parecem ser transferidas para o embrião através da clara de ovo, mais tarde constituindo a maior parte da população bacteriana intestinal5. Além disso, outro estudo sugeriu que parte dos colonizadores microbianos abrigados em embriões primitivos foram herdados de galinhas maternas, e a abundância e diversidade microbiana intestinal foram posteriormente influenciadas por fatores ambientais e genética hospedeira durante o desenvolvimento23. No entanto, os resultados desses estudos são baseados na análise de sequência de DNA, onde um grande número dessas bactérias pode estar morta ou não replicável na clara de ovo (muito carregada com moléculas antimicrobianas). Thomas e colaboradores16 realizaram testes de esterilidade através da avaliação de bactérias aeróbicas cultivable aeróbicas e facultativas através da queda fecal em placas de BHI, destacando assim a eficiência dos métodos bacteriológicos padrão para o controle da esterilidade livre de germes. Além disso, no protocolo proposto, utilizamos o monitoramento de crescimento no caldo de tioglicolato com resazurina para detectar o crescimento de bactérias anaeróbicas nãofastidiosas.
Já utilizado para a produção de codornas e galinhas livres de germes, o protocolo é adaptável à produção de animais livres de germes da maioria das aves de ninho e oferece perspectivas para o estudo da contribuição da microbiota para a fisiologia desses animais. Além do uso desse modelo para investigar interações mútuas hospedeira-microbiota no intestino avícola, também pode ser útil para a pesquisa aplicada. Por exemplo, poderia ser usado para avaliar a segurança e a eficácia de probióticos derivados de microrganismos commensais de intestino de frango para melhorar a saúde e robustez do animal.

Houve um aumento dramático do interesse científico e popular em relação à contribuição da microbiota intestinal para a saúde animal. A microbiota, composta por bactérias, vírus, fungos e arqueias que habitam diferentes nichos no intestino do animal, está implicada direta ou indiretamente na regulação de doenças inflamatórias, infecciosas e metabólicas que afetam não apenas espécies de mamíferos, mas também animais, como aves1. Vários modelos animais foram desenvolvidos para melhor estudar a contribuição da microbiota intestinal para a saúde e a doença. Por exemplo, animais sem germes e gnotobióticos permitem o estudo da ausência completa de micróbios ou de uma microbiota conhecida, respectivamente, sobre a fisiopatologia das infecções 2,3. No entanto, gerar e manter esses animais requer técnicas e instalações especializadas, e os custos, mão-de-obra e habilidades necessárias para mantê-los limitam seu acesso a muitos pesquisadores. De fato, animais livres de germes devem ser monitorados regularmente para possíveis contaminações usando uma combinação de métodos de cultivo de bactérias, microscopia, sorologia, morfologia bruta e técnicas de detecção baseadas em sequenciamento. Procedimentos semelhantes também se aplicam a outras espécies, como a pecuária, onde os animais são geralmente maiores e requerem instalações maiores para sua reprodução e manutenção, o que pode dificultar, em certa medida, pesquisas sobre a microbiota.
As aves de capoeira, mais especificamente as galinhas, são a pedra angular da produção pecuária em todo o mundo, com uma população de rebanhos que pode ultrapassar 40 bilhões de aves por ano. É a fonte mais importante de proteína animal no mundo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Além disso, não há tabus culturais ou religiosos associados à criação ou consumo de galinhas. A microbiota intestinal de aves está importantemente envolvida no crescimento do animal, na razão de conversão de ração, imunidade, resistência ao patógeno, entre muitos outros processos nutricionais, fisiológicos ou patológicos4. A geração de frangos sem germes é, portanto, indispensável para ressaltar o diálogo entre a microbiota e seu hospedeiro4. Mesmo que as comunidades microbianas habitem o ovidutode frango 5, o conteúdo de um ovo recém-colocado por uma galinha saudável é, em sua maioria, livre de microrganismos, casca de ovo e membranas que possuem barreiras mecânicas para evitar a invasão de microrganismos4. Além disso, os filhotes são facilmente criados na ausência de seus parentes, o que, ao contrário dos mamíferos, permite a produção de animais livres de germes sem criação dos pais em condições estéreis.
A instalação experimental "Infectiologia da Fazenda, Modelo e Animais Silvestres" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, França, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) faz parte da Rede Nacional de Infraestrutura Francesa EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). A PFIE dominou a produção de frangos sem germes para realizar vários estudos experimentais por mais de 40 anos 7,8,9,10,11. Esses animais foram produzidos a partir de ovos específicos livres de patógenos (SPF) de uma linha de desarmamento de leghorn branca criada em reprodução fechada desde a década de 1970. Utilizadas principalmente para estudos microbiológicos 7,8,9, aves sem germes estão experimentando um ressurgimento do interesse com questões como a contribuição da microbiota intestinal para o comportamento13, utilização de nutrientes14, desenvolvimento imunológico15 e atividade endócrina. Mesmo que alguns estudos tenham sido publicados usando as linhas de frango sem germes16, esses estudos permanecem sub-representados em comparação com estudos usando linhas de camadas experimentais. A evolução das questões científicas para o crosstalk entre a microbiota e seu hospedeiro em saúde e bem-estar avícola nos levou a adaptar nosso protocolo histórico para produzir frangos sem germes da linha Ross PM3, a linha de frango de corte mais utilizada do mundo.

<table><tbody><tr><td>2 mL sterile plastic pipettes</td><td>Starsted</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI agar plates</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion broth</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL BHI broth</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Hatching incubator</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td></td><td>for bacteriological culture, 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Irradiated feed</td><td>Safe</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG irradiated</td></tr><tr><td>Isolators</td><td></td><td></td><td>home made. 1 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; rigid isolator under positive pressure</td></tr><tr><td>Microbiological safety cabinet</td><td>thermon electron corporation</td><td></td><td>model: Hera Safe</td></tr><tr><td>Microscope Visiscope series 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile sealed boxes</td><td>Tuperware</td><td></td><td>diameter</td></tr><tr><td>Sterilized glass tube</td><td></td><td></td><td>&quot;sovirel&quot;</td></tr><tr><td>Thioglycolate Broth with Resazurin</td><td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &amp;deg;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td></tr></tbody></table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Estudos da contribuição da microbiota intestinal para a fisiologia e imunocompetência do hospedeiro são facilitados pela disponibilidade de modelos animais livres de germes, que são considerados o padrão-ouro. Aves de ninho são modelos ideais para a produção de animais livres de germes, já que não há necessidade de criar seus parentes em condições estéreis. As galinhas livres de germes são geradas principalmente a partir de linhas experimentais específicas sem patógenos (SPF), que são pouco representativas das linhas comerciais de frango. O método aqui proposto permitiu a produção de frangos sem germes a partir da linha de frangos de corte de rápido crescimento Ross PM3, comumente utilizada pela indústria avícola. Os ovos foram rapidamente coletados depois de colocar em uma fazenda de criadores de frangos. Eles foram submetidos a um rigoroso processo de descontaminação desde a coleta até a introdução em um isolador de estéril de eclosão de ovos. Os filhotes foram eclodidos e mantidos nestes isoladores estéreis durante o período necessário para controlar sua esterilidade. Originalmente desenvolvido para uma linha experimental de leghorn branco SPF, o presente protocolo foi adaptado não apenas para a linha de frango ross PM3, mas também para codornas. Representa, portanto, um procedimento robusto e prontamente adaptável a outras espécies avícolas e aves de ninho de relevância econômica, biológica ou ecológica.

Seis corridas de geração de filhotes livres de germes foram conduzidas com ovos Ross PM3 provenientes de duas fazendas francesas diferentes (Tabela 1). Foram coletados 853 ovos e, após duas etapas de descontaminação e 19 dias de incubação, 86,40% foram viáveis. 490 desses ovos viáveis passaram por uma terceira etapa de descontaminação e foram introduzidos em vários isoladores de eclosão, para uma taxa média de incubação de 79,80%. Isso representa uma taxa de eclosão de 68,94% em relação ao número inicial de ovos coletados.
No entanto, os resultados de eclosão variam substancialmente de acordo com a série realizada: de 41,67% para 88,16% dos filhotes viáveis em comparação com o número de ovos coletados. Essas variações também foram observadas entre as diferentes escotilhas durante o mesmo experimento. Uma vez que nem todos os isoladores têm sido usados para todas as corridas, é difícil excluir um efeito dependente de isolador. No entanto, este efeito em lote foi diretamente correlacionado com a idade das galinhas poedeiras (Figura 1), onde os ovos provenientes de galinhas mais velhas eram menos viáveis.
As seis corridas foram realizadas usando quatro isoladores de eclosão diferentes. Após o controle bacteriológico, os animais de 14 dos 16 isoladores foram confirmados como livres de germes. Isso corresponde a uma taxa de sucesso de 87,5%. Os dois isoladores restantes foram contaminados por uma única bactéria ambiental e não-patática.
Todos os animais usados para os experimentos científicos permaneceram livres de germes até o final dos estudos, por pelo menos três semanas após a eclosão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Figura 1: Efeito da idade da galinha na taxa de eclosão O presente número destaca as taxas de eclosão observadas com base na idade do rebanho de galinhas em pondo, expressas em semanas de colocação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ovos coletados</td>
			<td>D19 ovos viáveis</td>
			<td>D19 ovos viáveis/ovos coletados</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 1</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 2</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 3</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 4</td>
			<td>total de ovos transferidos</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 1</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 2</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 3</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 4</td>
			<td>total de filhotes viáveis eclodidos</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados1</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados2</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados3</td>
			<td>isolador de ovos hatched/transfered viável4</td>
			<td c="">ovos viáveis eclodidos/transferidos globais</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resultados técnicos dos diferentes experimentos de incubação. A presente tabela destaca os resultados da série de 6 eclosões sem germes realizadas: número de ovos coletados, viabilidade do embrião aos 19 dias e filhotes viáveis nos diversos isoladores.

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Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.

Produção de frangos de corte de crescimento rápido sem germes de uma linha comercial para estudos de microbiota

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K visualizações.  INRAE, PFIE, UE-1277. Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.

Vídeo: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Biologia do Desenvolvimento

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial community assembly. This protocol outlines a system for studying microbial community dynamics in the phyllosphere of Napa cabbage plants. It describes how to grow germ-free plants in test tubes with a calcined clay and nutrient broth substrate. Inoculation of germ-free plants with specific microbial cultures provides opportunities to measure microbial growth and community dynamics in the phyllosphere. Through the use of sterile vegetable extract produced from cabbages shifts in microbial communities that occur during fermentation can also be assessed. This system is relatively simple and inexpensive to set up in the lab and can be used to address key ecological questions in microbial community assembly. It also provides opportunities to understand how phyllosphere community composition can impact the microbial diversity and quality of vegetable fermentations. This approach for developing gnotobiotic cabbage phyllosphere communities could be applied to other wild and agricultural plant species.

A method of growing germ-free Napa cabbages has been developed which enables researchers to evaluate how single microbial species or multispecies microbial communities interact on cabbage leaf surfaces. A sterile vegetable extract is also presented which can be used to measure shifts in community composition during vegetable fermentation.

Um sistema gnotobiótico para estudar a montagem do microbioma na Fistofera e na Fermentação Vegetal

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Ambiente

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. Chicken embryos provide the opportunity to isolate preadipocytes from the earliest stage of adipose development. This primary cell can be used to identify factors influencing preadipocyte proliferation and adipogenic differentiation, making them a valuable model for studies related to childhood obesity and control of excess fat deposition in poultry. The rapid growth of postnatal adipose tissue effectively wastes feed by allocating it away from muscle growth in broiler chickens. Therefore, methods to understand the earliest stages of adipose tissue development may provide clues to regulate this tendency and identify ways to limit adipose expansion early in life. The present study was designed to develop an efficient method for isolation, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes isolated from developing adipose tissue of commercial broiler (meat-type) chick embryos. The procedure has been optimized to yield cells with high viability (~98%) and increased capacity to differentiate into mature adipocytes. This simple method of embryonic preadipocyte isolation, culture, and differentiation supports functional analyses of fat growth and development in early life.

The present protocol describes a simple method for isolating preadipocytes from adipose tissue in broiler embryos. This method enables isolation with high yield, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes. Oil Red O staining and lipid/DNA stain measured the adipogenic ability of isolated cells induced with differentiation media.

Isolamento de Preadipócitos de Embriões de Broiler Chick

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Otimizando modelos de peixe-zebra GF: geração, manutenção e estudos microbianos

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autor em destaque: Estabelecendo o peixe-zebra livre de germes para estudos de relacionamento entre microbiota e hospedeiro

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

Preparação e Manutenção do Experimento de Gaiola IsoPositivo de Bioexclusão para Transplante Fecal Humano em Camundongos Livres de Germes

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Imunologia e Infecção

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Estabelecimento e Manutenção de Baratas Gnotobióticas Americanas (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Biologia

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain into an axenic insect is a powerful method to verify gut microbial function and elucidate the mechanisms underlying gut microbe-host interactions. Administering antibiotics or sterilizing egg surfaces are two commonly used methods to remove gut bacteria from insects. However, in addition to the potential adverse effects of antibiotics on insects, previous studies indicated that feeding antibiotics could not eliminate gut bacteria. Thus, germ-free artificial diets are generally employed to maintain axenic insects, which is a tedious and labor-intensive process that cannot fully resemble nutritional components in natural food. Described here is an efficient and simple protocol to prepare and maintain axenic larvae of a leaf beetle&#160;(Plagiodera versicolora). Specifically, surfaces of the beetle eggs were sterilized, following which germ-free poplar leaves were used to rear axenic larvae. The axenic status of the insects was further confirmed via culture-dependent and culture-independent assays. Collectively, by combining egg disinfection and germ-free cultivation, an efficient and convenient method was developed to obtain axenic P. versicolora, providing a readily transferable tool for other leaf-eating insects.

To obtain an axenic insect, its egg surface is sterilized, and the hatched larva is subsequently reared using axenic leaves. This method provides an efficient way for axenic insect preparation without administering antibiotics or developing an artificial diet, which can also be applied to other leaf-eating insects.

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Estudando o desenvolvimento de Delia antiqua axênica e garantindo o crescimento livre de bactérias

Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets

Axenic insects are obtained from sterile artificial rearing systems using sterile media. These insects, characterized by their small size, short growth cycle, and low feed requirements, are ideal for studying the relationship between microorganisms and hosts. The gut microbiota significantly influences the physiological characteristics of insect hosts, and introducing specific strains into axenic insects provides a method for verifying gut microbial functions. Delia antiqua, a threatening pest in the order Diptera, family Anthomyiidae, and genus Delia, primarily feeds on onions, garlic, leeks, and other vegetables of the family Liliaceae. Its larvae feed on the bulbs, causing rotting, wilting, and even death of entire plants. By rearing axenic larvae, follow-up studies can be conducted to observe the effects of intestinal microflora on the growth and development of D. antiqua. Unlike the method involving antibiotic elimination of associated microbes, this article presents a low-cost and high-efficiency approach to raising axenic D. antiqua. After surface sterilization of D. antiqua eggs, half-fermented sterile diets were used to raise larvae, and the axenic state of D. antiqua was verified through culture-dependent and culture-independent assays. In conclusion, the combination of insect egg sterilization and the preparation of sterile diets for larval culture has enabled the development of an efficient and simple method for obtaining axenic D. antiqua. This method provides a powerful approach to studying insect-microflora interactions.

Autor em destaque: criação axênica de Delia antiqua para detectar o impacto dos micróbios intestinais em seu crescimento e desenvolvimento 

A simple procedure for rearing axenic Delia antiqua with half-fermented sterile diets is described. Only one Wolbachia strain was detected in each instar of axenic D. antiqua using PCR.

Criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas

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