Os autores agradecem aos criadores e à sociedade Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, França) pelo fornecimento de ovos fertilizados. Este estudo foi realizado sob os auspícios do consórcio de pesquisa APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), financiado pelo Centro Région Val de Loire, na França.

Os procedimentos de cuidado animal foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (86/609/CEE) e pelas regulamentações francesas sobre experimentação animal.
1. Preparação do isolador
<ol><li>Insira os materiais necessários em um isolador rígido sob pressão positiva: tubos de 50 mL, pipetas plásticas de 5, 10 e 25 mL, ração irradiada, água autoclavada e recipientes plásticos selados estéreis.</li>
	<li>Encha a armadilha germicidal de transferência com uma solução de amônio quaternário de 2%.</li>
	<li>Esterilize o isolador três vezes com vapor de formaldeído usando 60 mL de formalina (24% de formaldeído) adicionado a 30 g de permangante de potássio por metro cúbico (m3). Mova os materiais dentro do isolador entre cada esterilização para garantir a esterilização de todas as superfícies de contato.</li>
	<li>Coloque a temperatura isoladara para 37 °C por pelo menos 2 dias antes de introduzir os ovos. Coloque o higrômetro em 65-70% de umidade relativa (RH) no dia da introdução.</li>
</ol>2. Coleta e incubação de ovos
<ol><li>Recolher os ovos das fazendas selecionadas com base em uma boa taxa de eclosão das galinhas poedeiras (pelo menos 80% no pico da produção de ovos) e seu bom estado sanitário (ou seja, ausência de patógenos de aves comuns e ausência de doenças dentro do rebanho). Selecione visualmente ovos limpos e impecáveis na esteira.</li>
	<li>Descontamine imediatamente a superfície do ovo mergulhando-as por 5 minutos em uma solução de ácido peracético de 1,5% à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transporte os ovos para a instalação experimental usando uma caixa descontaminada com vapor formaldeído.</li>
	<li>Guarde os ovos por 24 horas a 4 °C. Repita o processo de descontaminação descrito na etapa 2.2 e coloque-os em uma incubadora de incubação (Dia 0) por 19 dias.</li>
</ol>3. Incubação
<ol><li>No dia 19, verifique a fertilidade, a viabilidade (motilidade) e o desenvolvimento do embrião, usando um candler de ovo leve em condições estéreis. Introduza apenas ovos embriados vivos nos isoladores estéreis de eclosão.</li>
	<li>Descontamine os ovos selecionados pulverizando 1,5% de solução de ácido peracético para 30 s ou até que toda a superfície de cada ovo esteja coberta. Os ovos permanecerão em contato com o spray por 16 minutos e 30 s durante a transferência para isoladores.</li>
	<li>Transfira os ovos para os isoladores estéreis de eclosão e enxágue-os com água desmineralizada estéril antes de colocá-los no espaço de eclosão. NOTA: Os animais são eclodidos e criados em isoladores estéreis. Eles são alimentados com ad libitum com uma dieta comercial esterilizada pela irradiação gama e regada com água da torneira autoclavada fornecida por distribuidores de água.</li>
</ol>4. Análise do estado bacteriológico
<ol><li>Um dia após a eclosão, pegue uma amostra fecal diretamente do reto de diferentes filhotes e acumule-os em um tubo de vidro esterilizado, a fim de tornar esta amostra representativa de todos os animais dentro de um determinado isolador.</li>
	<li>As amostras fecais sendo mais ou menos líquidas, adicionam um equivalente de 1 mL de fezes a 9 mL de caldo de tioglicolato com resazurina. Adicione a amostra fecal restante a 9 mL de caldo de infusão do coração cerebral (BHI) e incubar os tubos a 37 °C sem tremer por 18 a 48 h. Isso permitirá o crescimento de uma ampla gama de espécies aeróbicas aeróbicas, facultativas e não versíbicas. NOTA: O caldo de tiaglicolato com resazurina destina-se à detecção de bactérias anaeróbicas não versíduas, mas também permite a detecção de bactérias aeróbicas. Este meio está em conformidade com as farmacocopoias europeias, americanas e japonesas para testes de esterilidade 18,19,20.</li>
	<li>Observe visualmente se alguma modificação na mídia de crescimento ocorre após 18 horas de incubação. Depois de 48 h, pegue uma gota da mídia de caldo fecal bhi, coloque-o em um slide de vidro e observe sob um microscópio (ampliação 40X) para a ausência ou presença de bactérias.</li>
	<li>Se houver suspeita sobre a presença de bactérias, pegue uma amostra da cultura BHI e semee-a em placas de ágar BHI. Incubar a 37 °C por 18 a 48 h.</li>
	<li>Se as colônias estiverem presentes, realize técnicas de alta produtividade, como espectrometria de massa MALDI-TOF para identificação microbiana precisa. NOTA: Após 72 h, se as análises bacteriológicas forem negativas, os animais são declarados livres de germes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology.">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li><li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system.">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li><li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fern&#225;ndez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota,+gut+health+and+chicken+productivity:+what+is+the+connection?.">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?.</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota.">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).</li><li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg:+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation.">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li><li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens.">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li><li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+(type+1)+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli.">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li><li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides,+which+improves+intestinal+colonization.">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li><li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Br&#233;e, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain.">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).</li><li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+(Coturnix+japonica).">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li><li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens.">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li><li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens.">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).</li><li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken.">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li><li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , (2009).</li><li>Japanese Pharmacopoeia, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , (2009).</li><li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), (2008).</li><li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+chicks:+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods.">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li><li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick.">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens.">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Vários métodos para gerar galinhas sem germes foram descritos anteriormente 7,21,22. Métodos simples, como o apresentado aqui, utilizam diferentes desinfetantes para reduzir a carga bacteriana na superfície do ovo e nos isoladores. Os desinfetantes mais usados são cloreto mercurico, amônio quaternário, iodoforme, hipoclorito de sódio e soluções de dióxido de cloro. Os resultados são muitas vezes satisfatórios. No entanto, apesar da acessibilidade desses métodos, poucas estruturas podem aplicar o método e criar os animais em larga escala, tornando a utilização de frangos livres de germes uma abordagem relativamente rara, usada apenas para abordar questões científicas muito específicas. Os métodos, materiais e equipamentos descritos aqui permitem uma proporção de eclosão altamente eficiente de frangos sem germes, que permanecem saudáveis e estéreis por pelo menos 3 semanas (a duração dos experimentos científicos aos quais foram produzidos).
Os resultados mostram que a adaptação do protocolo à produção de filhotes livres de germes a partir de ovos coletados em granjas comerciais de aves é bem sucedida. A experiência com a produção de ovos spf revela que a eficiência do eclosão depende principalmente da idade das galinhas poedeiras e da qualidade dos ovos coletados. Ambos os parâmetros foram levados em consideração quando as fazendas foram escolhidas e os ovos coletados. Usando o mesmo método, a taxa média de eclosão de frangos sem germes é muito melhor do que a obtida na última produção de galinhas poedeiras spf em nossa instalação (79% vs 35%), sem afetar a esterilidade animal (87% vs 83%). Essas diferenças podem estar associadas ao contexto genético das aves (frangos de corte versus camadas) bem como à qualidade da casca de ovo, que provavelmente será mais frágil nos ovos dos animais da FPS, mantidos em reprodução fechada por mais de 40 anos. Além disso, também mostramos que o transporte de mais de 2h (das fazendas até a instalação experimental) não afeta a eficiência e a qualidade do eclosão.
Embora o processo de esterilização utilizado para isoladores de eclosão e o protocolo de descontaminação de ovos tenham sido otimizados, cerca de 10% dos isoladores não estavam livres de germes. Para entender a origem da contaminação, é muito importante realizar o controle de esterilização de rotina dos isoladores eclodidos antes da introdução do ovo.
Quanto ao estado de esterilidade das aves, tentamos aplicar métodos que permitem o crescimento de bactérias anaeróbicas aeróbicas e não versíbicas a partir de amostras fecais, garantindo assim que estamos detectando bactérias vivas e viáveis. Esses métodos estão em conformidade com as farmacopeias internacionais para testes de esterilidade e representam técnicas rápidas, fáceis e reduzidas de custos para serem usadas rotineiramente. No entanto, técnicas de biologia molecular, como o sequenciamento genético de rRNA 16S, embora não fornecendo informações sobre viabilidade de bactérias, podem ser aplicadas para a confirmação da presença de bactérias nãocultivais. De fato, um estudo recente sugeriu que algumas bactérias da microbiota oviduto materno parecem ser transferidas para o embrião através da clara de ovo, mais tarde constituindo a maior parte da população bacteriana intestinal5. Além disso, outro estudo sugeriu que parte dos colonizadores microbianos abrigados em embriões primitivos foram herdados de galinhas maternas, e a abundância e diversidade microbiana intestinal foram posteriormente influenciadas por fatores ambientais e genética hospedeira durante o desenvolvimento23. No entanto, os resultados desses estudos são baseados na análise de sequência de DNA, onde um grande número dessas bactérias pode estar morta ou não replicável na clara de ovo (muito carregada com moléculas antimicrobianas). Thomas e colaboradores16 realizaram testes de esterilidade através da avaliação de bactérias aeróbicas cultivable aeróbicas e facultativas através da queda fecal em placas de BHI, destacando assim a eficiência dos métodos bacteriológicos padrão para o controle da esterilidade livre de germes. Além disso, no protocolo proposto, utilizamos o monitoramento de crescimento no caldo de tioglicolato com resazurina para detectar o crescimento de bactérias anaeróbicas nãofastidiosas.
Já utilizado para a produção de codornas e galinhas livres de germes, o protocolo é adaptável à produção de animais livres de germes da maioria das aves de ninho e oferece perspectivas para o estudo da contribuição da microbiota para a fisiologia desses animais. Além do uso desse modelo para investigar interações mútuas hospedeira-microbiota no intestino avícola, também pode ser útil para a pesquisa aplicada. Por exemplo, poderia ser usado para avaliar a segurança e a eficácia de probióticos derivados de microrganismos commensais de intestino de frango para melhorar a saúde e robustez do animal.

Houve um aumento dramático do interesse científico e popular em relação à contribuição da microbiota intestinal para a saúde animal. A microbiota, composta por bactérias, vírus, fungos e arqueias que habitam diferentes nichos no intestino do animal, está implicada direta ou indiretamente na regulação de doenças inflamatórias, infecciosas e metabólicas que afetam não apenas espécies de mamíferos, mas também animais, como aves1. Vários modelos animais foram desenvolvidos para melhor estudar a contribuição da microbiota intestinal para a saúde e a doença. Por exemplo, animais sem germes e gnotobióticos permitem o estudo da ausência completa de micróbios ou de uma microbiota conhecida, respectivamente, sobre a fisiopatologia das infecções 2,3. No entanto, gerar e manter esses animais requer técnicas e instalações especializadas, e os custos, mão-de-obra e habilidades necessárias para mantê-los limitam seu acesso a muitos pesquisadores. De fato, animais livres de germes devem ser monitorados regularmente para possíveis contaminações usando uma combinação de métodos de cultivo de bactérias, microscopia, sorologia, morfologia bruta e técnicas de detecção baseadas em sequenciamento. Procedimentos semelhantes também se aplicam a outras espécies, como a pecuária, onde os animais são geralmente maiores e requerem instalações maiores para sua reprodução e manutenção, o que pode dificultar, em certa medida, pesquisas sobre a microbiota.
As aves de capoeira, mais especificamente as galinhas, são a pedra angular da produção pecuária em todo o mundo, com uma população de rebanhos que pode ultrapassar 40 bilhões de aves por ano. É a fonte mais importante de proteína animal no mundo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Além disso, não há tabus culturais ou religiosos associados à criação ou consumo de galinhas. A microbiota intestinal de aves está importantemente envolvida no crescimento do animal, na razão de conversão de ração, imunidade, resistência ao patógeno, entre muitos outros processos nutricionais, fisiológicos ou patológicos4. A geração de frangos sem germes é, portanto, indispensável para ressaltar o diálogo entre a microbiota e seu hospedeiro4. Mesmo que as comunidades microbianas habitem o ovidutode frango 5, o conteúdo de um ovo recém-colocado por uma galinha saudável é, em sua maioria, livre de microrganismos, casca de ovo e membranas que possuem barreiras mecânicas para evitar a invasão de microrganismos4. Além disso, os filhotes são facilmente criados na ausência de seus parentes, o que, ao contrário dos mamíferos, permite a produção de animais livres de germes sem criação dos pais em condições estéreis.
A instalação experimental "Infectiologia da Fazenda, Modelo e Animais Silvestres" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, França, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) faz parte da Rede Nacional de Infraestrutura Francesa EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). A PFIE dominou a produção de frangos sem germes para realizar vários estudos experimentais por mais de 40 anos 7,8,9,10,11. Esses animais foram produzidos a partir de ovos específicos livres de patógenos (SPF) de uma linha de desarmamento de leghorn branca criada em reprodução fechada desde a década de 1970. Utilizadas principalmente para estudos microbiológicos 7,8,9, aves sem germes estão experimentando um ressurgimento do interesse com questões como a contribuição da microbiota intestinal para o comportamento13, utilização de nutrientes14, desenvolvimento imunológico15 e atividade endócrina. Mesmo que alguns estudos tenham sido publicados usando as linhas de frango sem germes16, esses estudos permanecem sub-representados em comparação com estudos usando linhas de camadas experimentais. A evolução das questões científicas para o crosstalk entre a microbiota e seu hospedeiro em saúde e bem-estar avícola nos levou a adaptar nosso protocolo histórico para produzir frangos sem germes da linha Ross PM3, a linha de frango de corte mais utilizada do mundo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">2 mL sterile plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;">Starsted</td>
			<td style="width:119px;">86.1252.001</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BHI agar plates</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">PO1198A</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Brain Heart Infusion broth</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL BHI broth</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hatching incubator</td>
			<td style="width:153px;">Fieme</td>
			<td style="width:119px;">MG 576</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Incubator</td>
			<td style="width:153px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">for bacteriological culture, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Irradiated feed</td>
			<td style="width:153px;">Safe</td>
			<td style="width:119px;">U8983G10R</td>
			<td style="width:389px;">40 kG irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:243px;">Isolators</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Microbiological safety cabinet</td>
			<td style="width:153px;">thermon electron corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: Hera Safe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope Visiscope series 300</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:153px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile sealed boxes</td>
			<td style="width:153px;">Tuperware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterilized glass tube</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">&#34;sovirel&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Thioglycolate Broth with Resazurin</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">90404-500G</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Water bath</td>
			<td style="width:153px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &#176;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Estudos da contribuição da microbiota intestinal para a fisiologia e imunocompetência do hospedeiro são facilitados pela disponibilidade de modelos animais livres de germes, que são considerados o padrão-ouro. Aves de ninho são modelos ideais para a produção de animais livres de germes, já que não há necessidade de criar seus parentes em condições estéreis. As galinhas livres de germes são geradas principalmente a partir de linhas experimentais específicas sem patógenos (SPF), que são pouco representativas das linhas comerciais de frango. O método aqui proposto permitiu a produção de frangos sem germes a partir da linha de frangos de corte de rápido crescimento Ross PM3, comumente utilizada pela indústria avícola. Os ovos foram rapidamente coletados depois de colocar em uma fazenda de criadores de frangos. Eles foram submetidos a um rigoroso processo de descontaminação desde a coleta até a introdução em um isolador de estéril de eclosão de ovos. Os filhotes foram eclodidos e mantidos nestes isoladores estéreis durante o período necessário para controlar sua esterilidade. Originalmente desenvolvido para uma linha experimental de leghorn branco SPF, o presente protocolo foi adaptado não apenas para a linha de frango ross PM3, mas também para codornas. Representa, portanto, um procedimento robusto e prontamente adaptável a outras espécies avícolas e aves de ninho de relevância econômica, biológica ou ecológica.

Seis corridas de geração de filhotes livres de germes foram conduzidas com ovos Ross PM3 provenientes de duas fazendas francesas diferentes (Tabela 1). Foram coletados 853 ovos e, após duas etapas de descontaminação e 19 dias de incubação, 86,40% foram viáveis. 490 desses ovos viáveis passaram por uma terceira etapa de descontaminação e foram introduzidos em vários isoladores de eclosão, para uma taxa média de incubação de 79,80%. Isso representa uma taxa de eclosão de 68,94% em relação ao número inicial de ovos coletados.
No entanto, os resultados de eclosão variam substancialmente de acordo com a série realizada: de 41,67% para 88,16% dos filhotes viáveis em comparação com o número de ovos coletados. Essas variações também foram observadas entre as diferentes escotilhas durante o mesmo experimento. Uma vez que nem todos os isoladores têm sido usados para todas as corridas, é difícil excluir um efeito dependente de isolador. No entanto, este efeito em lote foi diretamente correlacionado com a idade das galinhas poedeiras (Figura 1), onde os ovos provenientes de galinhas mais velhas eram menos viáveis.
As seis corridas foram realizadas usando quatro isoladores de eclosão diferentes. Após o controle bacteriológico, os animais de 14 dos 16 isoladores foram confirmados como livres de germes. Isso corresponde a uma taxa de sucesso de 87,5%. Os dois isoladores restantes foram contaminados por uma única bactéria ambiental e não-patática.
Todos os animais usados para os experimentos científicos permaneceram livres de germes até o final dos estudos, por pelo menos três semanas após a eclosão.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Figura 1: Efeito da idade da galinha na taxa de eclosão O presente número destaca as taxas de eclosão observadas com base na idade do rebanho de galinhas em pondo, expressas em semanas de colocação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ovos coletados</td>
			<td>D19 ovos viáveis</td>
			<td>D19 ovos viáveis/ovos coletados</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 1</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 2</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 3</td>
			<td>Ovos tranferidos em isolador 4</td>
			<td>total de ovos transferidos</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 1</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 2</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 3</td>
			<td>filhotes viáveis eclodiram em isolador 4</td>
			<td>total de filhotes viáveis eclodidos</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados1</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados2</td>
			<td>viável eclodido/transfere ovos isolados3</td>
			<td>isolador de ovos hatched/transfered viável4</td>
			<td c="">ovos viáveis eclodidos/transferidos globais</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corrida 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resultados técnicos dos diferentes experimentos de incubação. A presente tabela destaca os resultados da série de 6 eclosões sem germes realizadas: número de ovos coletados, viabilidade do embrião aos 19 dias e filhotes viáveis nos diversos isoladores.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies at JoVE.com

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.

Produção de frangos de corte de crescimento rápido sem germes de uma linha comercial para estudos de microbiota

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K visualizações.  INRAE, PFIE, UE-1277. Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.

Vídeo: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Imunologia e Infecção

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse 1 H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos de Células-Tronco Pluripotentes

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Produção de frangos de corte de crescimento rápido sem germes de uma linha comercial para estudos de microbiota

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo