המחברים מודים למגדלים ולחברה Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, צרפת) על אספקת ביציות מופרות. מחקר זה נערך בחסות קונסורציום המחקר APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), אשר מומן על ידי מרכז רג'יון ואל דה לואר, צרפת.

נהלי הטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית (86/609/EEC) ועל ידי התקנות הצרפתיות בנושא ניסויים בבעלי חיים.
1. הכנת מבודד
<ol><li>הכנס את החומרים הדרושים לתוך מבודד קשיח בלחץ חיובי: צינורות 50 מ"ל, 5, 10 ו 25 מ"ל פיפטות פלסטיק, מזון מוקרן, מים אוטוקלאבים ומכלי פלסטיק אטומים סטריליים.</li>
	<li>מלאו את מלכודת ההעברה עם תמיסת אמוניום רבעונית של 2%.</li>
	<li>לעקר את המבודד שלוש פעמים עם אדי פורמלדהיד באמצעות 60 מ"ל של פורמלין (24% פורמלדהיד) בתוספת 30 גרם אשלגן פרמנגנט למטר מעוקב (m3). הזז את החומרים בתוך המבודד בין כל עיקור כדי להבטיח עיקור של כל משטחי המגע.</li>
	<li>הגדר את טמפרטורת המבודד ל -37 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפחות לפני החדרת הביצים. הגדר את מד המזמורים ל-65-70% מהלחות היחסית (RH) ביום ההקדמה.</li>
</ol>2. איסוף ביצים ודגירה
<ol><li>אספו את הביצים מחוות שנבחרו על בסיס קצב בקיעתן הטוב של התרנגולות המטילות (לפחות 80% בשיא ייצור הביצים) ומצבן הסניטרי הטוב (כלומר, היעדר פתוגנים נפוצים של עופות והיעדר מחלות בתוך הצאן). בחר באופן חזותי ביצים נקיות וללא רבב על ההליכון.</li>
	<li>נטרלו מיד את פני הביצה על ידי טבילתם למשך 5 דקות בתמיסת חומצה פראצטית של 1.5% בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים את הביצים למתקן הניסוי באמצעות קופסה עם אדי פורמלדהיד.</li>
	<li>אחסנו את הביצים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזרו על תהליך הפירוק המתואר בשלב 2.2, והניחו אותם בחממת בקיעה (יום 0) למשך 19 יום.</li>
</ol>3. בקיעה
<ol><li>ביום ה-19, אמתו את הפוריות, את הכדאיות (תנועתיות) ואת התפתחות העובר על ידי תפירתם באמצעות נר ביצית קל בתנאים סטריליים. הכניסו רק ביצים שעברו עובר חי לתוך מבודדי הבקיעה הסטרילית.</li>
	<li>נטרלו את הביצים שנבחרו על ידי ריסוס תמיסת חומצה פראצטית של 1.5% במשך 30 שניות או עד שכל פני השטח של כל ביצה מכוסים. ביצים ישמרו על קשר עם התרסיס במשך 16 דקות ו -30 שניות במהלך ההעברה למבודדים.</li>
	<li>מעבירים את הביצים למבודדים הבוקעים הסטריליים ושוטפים אותן במים סטריליים שעברו דה-מינרליזציה לפני שמניחים אותן בחלל הבקיעה. הערה: בעלי חיים בוקעים ומגודלים מבודדים סטריליים. הם מוזנים ב-ad libitum בתזונה מסחרית המעוקרת על ידי הקרנת גמא ומושקים במי ברז אוטוקלביים המסופקים על ידי מתקני מים.</li>
</ol>4. ניתוח מצב בקטריולוגי
<ol><li>יום אחד לאחר הבקיעה, קחו דגימת צואה ישירות מפי הטבעת של אפרוחים שונים ואספו אותם בצינור זכוכית מעוקר כדי להפוך דגימה זו למייצגת את כל בעלי החיים בתוך מבודד נתון.</li>
	<li>דגימות הצואה הן פחות או יותר נוזליות, מוסיפות שווה ערך של 1 מ"ל של צואה ל -9 מ"ל של ציר thioglycolate עם resazurin. מוסיפים את דגימת הצואה הנותרת ל-9 מ"ל של ציר עירוי לב במוח (BHI) ומדגרים את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 18 עד 48 שעות. זה יאפשר צמיחה של מגוון רחב של מינים אירוביים אירוביים, אירוביים פקולטטיביים ואנאירוביים שאינם עמידים. הערה: ציר Thioglycolate עם resazurin מיועד לזיהוי של חיידקים אנאירוביים שאינם עמידים, אך הוא גם מאפשר זיהוי של חיידקים אירוביים. מדיום זה תואם את הפרמקופיאה האירופית, האמריקאית והיפנית לבדיקת סטריליות 18,19,20.</li>
	<li>חזותית לראות אם כל שינוי במדיית הצמיחה מתרחשת לאחר 18 שעות של דגירה. לאחר 48 שעות, קחו טיפה ממדיית ציר הצואה של BHI, הניחו אותה על מגלשת זכוכית והתבוננו מתחת למיקרוסקופ (הגדלה של פי 40) להיעדר או נוכחות של חיידקים.</li>
	<li>אם יש חשד לגבי נוכחותם של חיידקים, קחו דגימה מתרבית BHI וזרעו אותה על צלחות אגר BHI. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 48 שעות.</li>
	<li>אם קיימות מושבות, בצע טכניקות בתפוקה גבוהה כגון ספקטרומטריית מסות MALDI-TOF לזיהוי מיקרוביאלי מדויק. הערה: לאחר 72 שעות, אם הניתוחים הבקטריולוגיים שליליים, בעלי החיים מוכרזים כנקיים מחיידקים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology.">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li><li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system.">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li><li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fern&#225;ndez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota,+gut+health+and+chicken+productivity:+what+is+the+connection?.">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?.</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota.">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).</li><li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg:+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation.">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li><li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens.">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li><li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+(type+1)+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli.">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li><li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides,+which+improves+intestinal+colonization.">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li><li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Br&#233;e, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain.">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).</li><li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+(Coturnix+japonica).">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li><li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens.">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li><li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens.">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).</li><li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken.">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li><li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , (2009).</li><li>Japanese Pharmacopoeia, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , (2009).</li><li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), (2008).</li><li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+chicks:+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods.">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li><li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick.">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens.">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מספר שיטות ליצירת תרנגולות ללא חיידקים תוארו בעבר 7,21,22. שיטות פשוטות, כמו זו המוצגת כאן, משתמשות בחומרי חיטוי שונים כדי להפחית את עומס החיידקים בפני השטח של הביצה ובמבודדים. חומרי החיטוי הנפוצים ביותר הם כספית כלוריד, אמוניום רבעוני, יודופורם, נתרן היפוכלוריט ותמיסות כלור דו חמצני. התוצאות הן לעתים קרובות משביעות רצון. עם זאת, למרות הנגישות של שיטות אלה, מעטים המבנים שיכולים ליישם את השיטה ולגדל את בעלי החיים בקנה מידה גדול, ובכך להפוך את השימוש בתרנגולות ללא חיידקים לגישה נדירה יחסית, המשמשת רק כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות מאוד. השיטות, החומרים והציוד המתוארים כאן מאפשרים שיעור בקיעה יעיל ביותר של יצורים ללא נבטים, שנשארים בריאים וסטריליים למשך 3 שבועות לפחות (משך הניסויים המדעיים שאליהם הם יוצרו).
התוצאות מראות כי התאמת הפרוטוקול לייצור אפרוחים ללא חיידקים מביצים שנאספו בחוות עופות מסחריות היא מוצלחת. הניסיון בייצור ביצי SPF מגלה כי יעילות הבקיעה תלויה בעיקר בגיל התרנגולות המטילות ובאיכות הביצים שנאספו. שני הפרמטרים נלקחו בחשבון כאשר נבחרו חוות וביצים נאספו. באותה שיטה, שיעור הבקיעה הממוצע של תרנגולות ללא נבטים הוא הרבה יותר טוב מזה שהושג בייצור האחרון של תרנגולות מינון SPF במתקן שלנו (79% לעומת 35%), מבלי להשפיע על עקרות בעלי החיים (87% לעומת 83%). הבדלים אלה עשויים להיות קשורים לרקע הגנטי של הציפורים (broilers לעומת שכבות) כמו גם לאיכות קליפת הביצה, אשר סביר להניח להיות שברירית יותר בביצים של בעלי החיים SPF, המוחזקים ברבייה סגורה במשך יותר מ -40 שנה. יתר על כן, אנו גם מראים כי הובלה של יותר מ 2 שעות (מן החוות למתקן הניסוי) אינו משפיע על יעילות הבקיעה ואיכות.
אף על פי שתהליך העיקור המשמש לבקיעת מבודדים והפרוטוקול לפירוק ביצים עברו אופטימיזציה, כ-10% מהמבודדים לא היו נקיים מחיידקים. על מנת להבין את מקור הזיהום, חשוב מאוד לבצע בקרת סטריליות שגרתית של מבודדי הבקיעה לפני הכנסת הביצים.
בנוגע למצב הסטריליות של הציפורים, ניסינו ליישם שיטות המאפשרות צמיחה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ולא עמידים מדגימות צואה, ובכך להבטיח שאנו מזהים חיידקים חיים בני קיימא. שיטות אלה תואמות את הפרמקופיות הבינלאומיות לבדיקות סטריליות ומייצגות טכניקות מהירות, קלות ומופחתות עלויות לשימוש שגרתי. עם זאת, ניתן ליישם טכניקות ביולוגיה מולקולרית כגון ריצוף גנים של 16S rRNA, אם כי לא נותנות מידע על כדאיות החיידקים, לאישור נוכחותם של חיידקים שאינם ניתנים לעיבוד. ואכן, מחקר שנערך לאחרונה העלה את ההשערה כי חלק מהחיידקים של המיקרוביוטה האימהית אובידוקט מועברים לעובר דרך חלבון הביצית, ובהמשך מהווים את רוב אוכלוסיית חיידקי המעיים העוברית5. יתר על כן, מחקר אחר העלה את ההשערה כי חלק מהמתיישבים המיקרוביאליים שהוכנסו לעוברים מוקדמים עברו בתורשה מתרנגולות אימהיות, והשפע והמגוון המיקרוביאליים של המעיים הושפעו מאוחר יותר מגורמים סביבתיים ומגנטיקה של המארחים במהלך התפתחות23. עם זאת, תוצאות המחקרים האלה מבוססות על ניתוח רצף דנ"א, שבו מספר גדול של חיידקים אלה יכולים להיות מתים או לא ניתנים לשכפול בחלבון הביצה (עמוס מאוד במולקולות אנטי-מיקרוביאליות). תומס ושותפיו16 ביצעו בדיקות סטריליות באמצעות הערכה של חיידקים אירוביים אירוביים וסיפקטיביים הניתנים לעיבוד באמצעות הטלת צואה על צלחות BHI, ובכך הדגישו את היעילות של שיטות בקטריולוגיות סטנדרטיות לבקרת סטריליות ללא חיידקים. יתר על כן, בפרוטוקול המוצע, השתמשנו בניטור גדילה בציר תיוגליקולאט עם רזאורין כדי להיות מסוגלים לזהות את הצמיחה של חיידקים אנאירוביים שאינם עמידים.
הפרוטוקול, שכבר שימש לייצור שליו ותרנגולות ללא נבטים, ניתן להתאמה לייצור בעלי חיים נטולי חיידקים מרוב הציפורים המקננות ומציע נקודות מבט לחקר תרומת המיקרוביוטה לפיזיולוגיה של בעלי חיים אלה. מלבד השימוש במודל זה כדי לחקור את האינטראקציות ההדדיות בין פונדקאי למיקרוביוטה במעי העופות, הוא עשוי להיות שימושי גם למחקר יישומי. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של פרוביוטיקה שמקורה במיקרואורגניזמים של המעיים כדי לשפר את בריאותם ועמידותם של בעלי החיים.

חלה עלייה דרמטית בהתעניינות המדעית והפופולרית בנוגע לתרומתה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות בעלי החיים. המיקרוביוטה, המורכבת מחיידקים, וירוסים, פטריות וארכיאה המאכלסים נישות שונות במעי החיה, מעורבת במישרין או בעקיפין בוויסות של מחלות דלקתיות, זיהומיות ומטבוליות המשפיעות לא רק על מיני יונקים אלא גם על בעלי חיים, כגון עופות1. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור טוב יותר את התרומה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות ולמחלות. לדוגמה, בעלי חיים נטולי חיידקים וגנוטוביוטים מאפשרים לחקור את היעדרם המוחלט של מיקרובים או של מיקרוביוטה ידועה, בהתאמה, על הפיזיופתולוגיה של זיהומים 2,3. עם זאת, יצירה ותחזוקה של בעלי חיים אלה דורשת טכניקות ומתקנים מיוחדים, והעלויות, העבודה והכישורים הנדרשים כדי לתחזק אותם מגבילים את גישתם לחוקרים רבים. ואכן, בעלי חיים ללא חיידקים חייבים להיות מנוטרים באופן קבוע לאיתור זיהום אפשרי באמצעות שילוב של שיטות גידול חיידקים, מיקרוסקופיה, סרולוגיה, מורפולוגיה גסה וטכניקות זיהוי מבוססות ריצוף. נהלים דומים חלים גם על מינים אחרים, כגון בעלי חיים, שבהם בעלי החיים בדרך כלל גדולים יותר ודורשים מתקנים גדולים יותר לצורך הרבייה והתחזוקה שלהם, מה שעלול לעכב, במידה מסוימת, את המחקר על המיקרוביוטה.
עופות, ליתר דיוק תרנגולות, הם אבן הפינה של ייצור בעלי חיים ברחבי העולם, עם אוכלוסיית להקות שעשויה לעלות על 40 מיליארד ציפורים בשנה. זהו המקור החשוב ביותר של חלבון מן החי בעולם (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). יתר על כן, אין טאבו תרבותי או דתי הקשור לגידול או לצריכה של תרנגולות. המיקרוביוטה של המעיים בעופות מעורבת באופן חשוב בגדילה של בעלי חיים, יחס המרת מזון, חסינות, עמידות בפני פתוגנים, בין תהליכים תזונתיים, פיזיולוגיים או פתולוגיים רבים אחרים4. הדור של תרנגולות ללא חיידקים הוא אפוא הכרחי כדי להדגיש את הדיאלוג בין המיקרוביוטה לבין המארחשלה 4. גם אם קהילות מיקרוביאליות מאכלסות את עוףoviduct 5, התוכן של ביצה שהוטלה זה עתה על ידי תרנגולת בריאה נקי ברובו ממיקרואורגניזמים, קליפת הביצה והממברנות בעלות מחסומים מכניים כדי למנוע פלישת מיקרואורגניזמים4. בנוסף, אפרוחים גדלים בקלות בהיעדר קרוביהם, אשר, בניגוד ליונקים, מאפשר ייצור של בעלי חיים ללא חיידקים ללא גידול הורי בתנאים סטריליים.
מתקן הניסוי "זיהום של חיות חווה, מודל וחיות בר" (PFIE, UE-1277, מרכז INRAE Val de Loire, Nouzilly, צרפת, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) הוא חלק מרשת התשתיות הלאומית הצרפתית EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE שולטת בייצור תרנגולות ללא חיידקים כדי לבצע מחקרים ניסיוניים שונים במשך יותר מ -40 שנה 7,8,9,10,11. בעלי חיים אלה הופקו מביצים ספציפיות ללא פתוגנים (SPF) מקו הטלת קרן רגל לבן שגדל ברבייה סגורה מאז שנות ה-70 של המאה ה-20. ציפורים ללא חיידקים, המשמשות בעיקר למחקרים מיקרוביולוגיים 7,8,9, חוות התעוררות מחודשת של עניין עם שאלות כמו תרומת המיקרוביוטה של המעיים להתנהגות13, ניצול מזין14, התפתחות מערכת החיסון15 ופעילות אנדוקרינית. גם אם חלק מהמחקרים פורסמו באמצעות קווי ברוילר16 נטולי חיידקים, מחקרים אלה עדיין אינם מיוצגים כראוי בהשוואה למחקרים המשתמשים בקווי שכבות ניסיוניים. האבולוציה של השאלות המדעיות לקראת ההצלבה בין המיקרוביוטה לבין המארח שלה בבריאות ורווחת העופות הובילה אותנו להתאים את הפרוטוקול ההיסטורי שלנו כדי לייצר ברוילרים נטולי חיידקים של קו Ross PM3, קו העוף הברוילר הנפוץ ביותר בעולם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">2 mL sterile plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;">Starsted</td>
			<td style="width:119px;">86.1252.001</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BHI agar plates</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">PO1198A</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Brain Heart Infusion broth</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL BHI broth</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hatching incubator</td>
			<td style="width:153px;">Fieme</td>
			<td style="width:119px;">MG 576</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Incubator</td>
			<td style="width:153px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">for bacteriological culture, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Irradiated feed</td>
			<td style="width:153px;">Safe</td>
			<td style="width:119px;">U8983G10R</td>
			<td style="width:389px;">40 kG irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:243px;">Isolators</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Microbiological safety cabinet</td>
			<td style="width:153px;">thermon electron corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: Hera Safe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope Visiscope series 300</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:153px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile sealed boxes</td>
			<td style="width:153px;">Tuperware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterilized glass tube</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">&#34;sovirel&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Thioglycolate Broth with Resazurin</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">90404-500G</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Water bath</td>
			<td style="width:153px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &#176;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

מחקרים על תרומת המיקרוביוטה של המעיים לפיזיולוגיה של המארח ולתכשירות חיסונית מתאפשרים הודות לזמינותם של מודלים של בעלי חיים נטולי חיידקים, הנחשבים לתקן הזהב. ציפורי קינון הן מודלים אידיאליים לייצור בעלי חיים ללא חיידקים, שכן אין צורך לגדל את קרוביהם בתנאים סטריליים. תרנגולות ללא חיידקים מופקות בעיקר מקווי ניסוי ספציפיים-נטולי פתוגנים (SPF), המייצגים בצורה גרועה קווי עוף מסחריים. השיטה שהוצעה כאן אפשרה ייצור של תרנגולות ללא חיידקים מקו הברוילרים הגדל במהירות רוס PM3, המשמש בדרך כלל את תעשיית העופות. הביצים נאספו במהירות לאחר הטלתן בחוות מגדלי תותחים. הם עברו תהליך טיהור קפדני מהאוסף ועד להקדמה בבידוד בקיעת ביצים סטרילי. האפרוחים בקעו ונשמרו במבודדים סטריליים אלה בתקופה הדרושה כדי לשלוט בעקרותם. הפרוטוקול הנוכחי, שפותח במקור עבור קו קרניים לבנים ניסיוני עם SPF, הותאם לא רק לקו ה-Ross PM3 broiler אלא גם לשליו. לפיכך הוא מייצג הליך חזק וניתן להתאמה בקלות למיני עופות אחרים ולציפורים מקננות בעלות רלוונטיות כלכלית, ביולוגית או אקולוגית.

שש ריצות של דור אפרוחים נטולי חיידקים נערכו עם ביצי רוס PM3 שהגיעו משתי חוות צרפתיות שונות (טבלה 1). בסך הכל נאספו 853 ביצים ולאחר שני שלבים של פירוק ו-19 ימי דגירה, 86.40% היו בני קיימא. 490 מהביצים הקיימות הללו עברו שלב פירוק שלישי והוכנסו לבידודים שונים של הבקיעה, לשיעור בקיעה ממוצע של 79.80%. נתון זה מייצג שיעור בקיעה של 68.94% בהשוואה למספר הביצים ההתחלתי שנאסף.
עם זאת, תוצאות הבקיעה משתנות באופן משמעותי בהתאם לסדרה שבוצעה: מ-41.67% ל-88.16% מהאפרוחים בני הקיימא בהשוואה למספר הביצים שנאספו. וריאציות אלה נצפו גם בין הפתחים השונים במהלך אותו ניסוי. מכיוון שלא כל המבודדים שימשו לכל הריצות, קשה להחריג השפעה התלויה במבודד. עם זאת, אפקט אצווה זה היה בקורלציה ישירה עם גילן של התרנגולות המטילות (איור 1), שם ביצים שהגיעו מתרנגולות מבוגרות יותר היו פחות בנות קיימא.
שש הריצות בוצעו באמצעות ארבעה מבודדי בקיעה שונים. לאחר בקרה בקטריולוגית, אושר כי בעלי החיים מ-14 מתוך 16 המבודדים היו נקיים מחיידקים. זה מתאים לשיעור הצלחה של 87.5%. שני המבודדים הנותרים היו מזוהמים על ידי חיידק סביבתי אחד ולא פתוגני.
כל בעלי החיים ששימשו לניסויים המדעיים נותרו נקיים מחיידקים עד סוף המחקרים, במשך שלושה שבועות לפחות לאחר הבקיעה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> איור 1: השפעת גיל התרנגולת על קצב הבקיעה הנתון הנוכחי מדגיש את שיעורי הבקיעה שנצפו על סמך גילו של עדר התרנגולות המטיל, שבא לידי ביטוי בשבועות של שכבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ביצים שנאספו</td>
			<td>D19 ביצים בנות קיימא</td>
			<td>D19 ביצים בנות קיימא/ביצים שנאספו</td>
			<td>ביצים שהוכנסו למבודד 1</td>
			<td>ביצים שהועתקו למבודד 2</td>
			<td>ביצים שהוכנסו למבודד 3</td>
			<td>ביצים שהועתקו למבודד 4</td>
			<td>סה"כ הביצים המועברות</td>
			<td>אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 1</td>
			<td>אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 2</td>
			<td>אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 3</td>
			<td>אפרוחים בני קיימא בקעו למבודד 4</td>
			<td>סה"כ אפרוחים בוקעים בני קיימא</td>
			<td>מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא1</td>
			<td>מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא2</td>
			<td>מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא3</td>
			<td>מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא4</td>
			<td c="">ביצים ברות קיימא שבקעו/הועברו ברחבי העולם</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריצה 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>סך</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תוצאות טכניות של ניסויי הבקיעה השונים. הטבלה הנוכחית מדגישה את התוצאות של 6 סדרות של בקיעה ללא חיידקים שבוצעו: מספר הביציות שנאספו, הכדאיות של העובר ב -19 יום וגוזלים בקעו בר קיימא במבודדים השונים.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies at JoVE.com

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

כאן אנו מתארים שיטה ליצירת אפרוחים ללא חיידקים מביצים של קו ברוילר מסחרי, Ross PM3. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדור של בעלי חיים ללא חיידקים ממיני עופות אחרים.

ייצור של ברוילרים ללא חיידקים הגדלים במהירות מקו מסחרי ללימודי מיקרוביוטה

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Views.  INRAE, PFIE, UE-1277. כאן אנו מתארים שיטה ליצירת אפרוחים ללא חיידקים מביצים של קו ברוילר מסחרי, Ross PM3. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדור של בעלי חיים ללא חיידקים ממיני עופות אחרים.

Video: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

ייצור של ברוילרים ללא חיידקים הגדלים במהירות מקו מסחרי ללימודי מיקרוביוטה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video