Die Autoren danken den Züchtern und dem Verein Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankreich) für die Lieferung von befruchteten Eiern. Diese Studie wurde unter der Schirmherrschaft des Forschungskonsortiums APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) durchgeführt, das vom Région Centre Val de Loire, Frankreich, finanziert wurde.

Die Tierpflegeverfahren wurden gemäß den Leitlinien der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften und der französischen Tierversuchsverordnung durchgeführt.
1. Isolator-Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie die erforderlichen Materialien unter Überdruck in einen starren Isolator ein: 50 ml Röhrchen, 5, 10 und 25 ml Kunststoffpipetten, bestrahltes Futter, autoklaviertes Wasser und steril verschlossene Kunststoffbehälter.</li>
	<li>Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2% igen quartären Ammoniumlösung.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, indem Sie 60 ml Formalin (24% Formaldehyd) zu 30 g Kaliumpermanganat pro Kubikmeter (m3) hinzufügen. Bewegen Sie die Materialien im Inneren des Isolators zwischen den einzelnen Sterilisationen, um die Sterilisation aller Kontaktflächen sicherzustellen.</li>
	<li>Stellen Sie die Isolatortemperatur für mindestens 2 Tage auf 37 °C ein, bevor die Eier eingeführt werden. Stellen Sie das Hygrometer am Tag der Einführung auf 65-70% der relativen Luftfeuchtigkeit (RH) ein.</li>
</ol>2. Eizellentnahme und -inkubation
<ol><li>Sammeln Sie die Eier von Betrieben, die auf der Grundlage einer guten Schlupfrate der Legehennen (mindestens 80% auf dem Höhepunkt der Eierproduktion) und ihres guten Gesundheitszustands (d. h. Fehlen von Geflügelpathogenen und Fehlen von Krankheiten innerhalb der Herde) ausgewählt wurden. Wählen Sie auf dem Laufband optisch saubere und makellose Eier aus.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie für 5 Minuten in eine 1,5% ige Peressigsäurelösung bei Raumtemperatur tauchen.</li>
	<li>Transportieren Sie die Eier mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.</li>
	<li>Lagern Sie die Eier 24 Stunden bei 4 °C. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen Dekontaminationsvorgang, und legen Sie sie 19 Tage lang in einen Brutkasten (Tag 0).</li>
</ol>3. Schraffur
<ol><li>Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, die Lebensfähigkeit (Motilität) und die Embryonalentwicklung, indem Sie sie mit einem hellen Eierkerzen unter sterilen Bedingungen kandieren. Geben Sie nur lebende embryonierte Eier in die sterilen Brutisolatoren ein.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie die ausgewählten Eier, indem Sie 1,5% ige Peressigsäurelösung für 30 s sprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist. Die Eier bleiben während des Transfers in Isolatoren 16 Minuten und 30 s in Kontakt mit dem Spray.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eier in die sterilen Schlupfisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Schlupfraum legen. HINWEIS: Die Tiere werden in sterilen Isolatoren geschlüpft und aufgezogen. Sie werden ad libitum mit einer kommerziellen Diät gefüttert, die durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser bewässert wird, das von Wasserspendern bereitgestellt wird.</li>
</ol>4. Bakteriologische Zustandsanalyse
<ol><li>Nehmen Sie einen Tag nach dem Schlüpfen eine Stuhlprobe direkt aus dem Rektum verschiedener Küken und sammeln Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen, um diese Probe repräsentativ für alle Tiere in einem bestimmten Isolator zu machen.</li>
	<li>Da die Stuhlproben mehr oder weniger flüssig sind, fügen Sie ein Äquivalent von 1 ml Stuhl zu 9 ml Thioglycolatbrühe mit Resazurin hinzu. Fügen Sie die verbleibende Stuhlprobe zu 9 ml Hirnherzinfusionsbrühe (BHI) hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C ohne Schütteln für 18 bis 48 h. Dies wird das Wachstum einer breiten Palette von aeroben, fakultativen aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Arten ermöglichen. HINWEIS: Thioglycolatbrühe mit Resazurin ist für den Nachweis von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien vorgesehen, ermöglicht aber auch den Nachweis von aeroben Bakterien. Dieses Medium entspricht den europäischen, amerikanischen und japanischen Arzneibüchern für Sterilitätstests18,19,20.</li>
	<li>Beobachten Sie visuell, ob nach 18 Stunden Inkubation eine Veränderung in den Wachstumsmedien auftritt. Nach 48 h nehmen Sie einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühemedium, legen Sie es auf einen Glasobjektträger und beobachten Sie unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) die Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien.</li>
	<li>Wenn der Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien besteht, nehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf BHI-Agarplatten aus. Bei 37 °C für 18 bis 48 h inkubieren.</li>
	<li>Wenn Kolonien vorhanden sind, führen Sie Hochdurchsatztechniken wie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur präzisen mikrobiellen Identifizierung durch. HINWEIS: Nach 72 h, wenn die bakteriologischen Analysen negativ sind, werden die Tiere für keimfrei erklärt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. 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J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. 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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mehrere Methoden zur Erzeugung keimfreier Hühner wurden zuvor beschrieben 7,21,22. Einfache Methoden, wie die hier vorgestellte, verwenden verschiedene Desinfektionsmittel, um die Keimbelastung in der Eioberfläche und in den Isolatoren zu reduzieren. Die am häufigsten verwendeten Desinfektionsmittel sind Quecksilberchlorid, quartäres Ammonium, Jodform, Natriumhypochlorit und Chlordioxidlösungen. Die Ergebnisse sind oft zufriedenstellend. Trotz der Zugänglichkeit dieser Methoden können jedoch nur wenige Strukturen die Methode anwenden und die Tiere in großem Maßstab aufziehen, was die Verwendung keimfreier Hühner zu einem relativ seltenen Ansatz macht, der nur zur Beantwortung sehr spezifischer wissenschaftlicher Fragen verwendet wird. Die hier beschriebenen Methoden, Materialien und Geräte ermöglichen einen hocheffizienten Schlüpfanteil keimfreier Masthähnchen, die mindestens 3 Wochen (die Dauer der wissenschaftlichen Experimente, zu denen sie hergestellt wurden) gesund und steril bleiben.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anpassung des Protokolls an die Produktion keimfreier Küken aus Eiern, die in kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt wurden, erfolgreich ist. Die Erfahrung mit der SPF-Eierproduktion zeigt, dass die Schlupfeffizienz in erster Linie vom Alter der Legehennen und von der Qualität der gesammelten Eier abhängt. Beide Parameter wurden bei der Auswahl der Betriebe und der Sammlung der Eier berücksichtigt. Mit der gleichen Methode ist die durchschnittliche Schlüpfrate von keimfreien Masthähnchen viel besser als bei der letzten Produktion von SPF-Legehennen in unserer Anlage (79% gegenüber 35%), ohne die Tiersterilität zu beeinträchtigen (87% vs. 83%). Diese Unterschiede können mit dem genetischen Hintergrund der Vögel (Masthähnchen versus Schichten) sowie mit der Qualität der Eierschale zusammenhängen, die in den Eiern der SPF-Tiere, die seit mehr als 40 Jahren in geschlossener Zucht gehalten werden, anfälliger ist. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass der Transport von mehr als 2 h (von den Farmen zur Versuchsanlage) die Schlupfeffizienz und -qualität nicht beeinträchtigt.
Obwohl der Sterilisationsprozess für Schlüpfisolatoren und das Protokoll für die Eizelldekontamination optimiert wurden, waren rund 10% der Isolatoren nicht keimfrei. Um den Ursprung der Kontamination zu verstehen, ist es sehr wichtig, eine routinemäßige Sterilitätskontrolle der geschlüpften Isolatoren vor der Eieinführung durchzuführen.
In Bezug auf den Sterilitätsstatus der Vögel haben wir versucht, Methoden anzuwenden, die das Wachstum von aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien aus Stuhlproben ermöglichen und so sicherstellen, dass wir lebende, lebensfähige Bakterien nachweisen. Diese Methoden entsprechen den internationalen Arzneibüchern für Sterilitätstests und stellen schnelle, einfache und kostenreduzierte Techniken dar, die routinemäßig angewendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die 16S rRNA-Gensequenzierung geben zwar keine Informationen über die Lebensfähigkeit von Bakterien, können jedoch zur Bestätigung des Vorhandenseins nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden. Tatsächlich deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass einige Bakterien der mütterlichen Eileitermikrobiota durch das Eiweiß auf den Embryo übertragen zu werden scheinen und später den größten Teil der embryonalen Darmbakterienpopulationausmachen 5. Darüber hinaus deutete eine andere Studie darauf hin, dass ein Teil der mikrobiellen Kolonisatoren, die in frühen Embryonen untergebracht waren, von mütterlichen Hühnern vererbt wurden und die mikrobielle Häufigkeit und Vielfalt des Darms später durch Umweltfaktoren und Wirtsgenetik während der Entwicklungbeeinflusst wurden 23. Die Ergebnisse dieser Studien basieren jedoch auf DNA-Sequenzanalysen, bei denen eine große Anzahl dieser Bakterien im Eiweiß (stark mit antimikrobiellen Molekülen beladen) tot oder nicht replizierbar sein könnte. Thomas und seine Mitarbeiter16 führten Sterilitätstests durch die Bewertung kultivierbarer aerober und fakultativer aerober Bakterien durch fäkales Abtropfen auf BHI-Platten durch und hoben so die Effizienz der bakteriologischen Standardmethoden zur keimfreien Sterilitätskontrolle hervor. Darüber hinaus haben wir in dem vorgeschlagenen Protokoll die Wachstumsüberwachung in Thioglycolatbrühe mit Resazurin verwendet, um das Wachstum von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien nachweisen zu können.
Das Protokoll, das bereits für die Produktion von keimfreien Wachteln und Hühnern verwendet wird, ist an die Produktion von keimfreien Tieren aus den meisten Brutvögeln anpassbar und bietet Perspektiven für die Untersuchung des Beitrags der Mikrobiota zur Physiologie dieser Tiere. Neben der Verwendung dieses Modells zur Untersuchung gegenseitiger Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota im Geflügeldarm könnte es auch für die angewandte Forschung nützlich sein. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Probiotika aus Hühnerdarm-kommensalen Mikroorganismen zu bewerten, um die Gesundheit und Robustheit der Tiere zu verbessern.

Das wissenschaftliche und populäre Interesse am Beitrag der Darmmikrobiota zur Tiergesundheit hat dramatisch zugenommen. Die Mikrobiota, bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, die verschiedene Nischen im Darm des Tieres bewohnen, ist direkt oder indirekt an der Regulation von entzündlichen, infektiösen und metabolischen Erkrankungen beteiligt, die nicht nur Säugetierarten, sondern auch Nutztiere wie Geflügelbetreffen 1. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um den Beitrag der Darmmikrobiota zu Gesundheit und Krankheit besser untersuchen zu können. Zum Beispiel ermöglichen keimfreie und gnotobiotische Tiere die Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von Mikroben bzw. einer bekannten Mikrobiota auf die Physiopathologie von Infektionen 2,3. Die Erzeugung und Pflege dieser Tiere erfordert jedoch spezielle Techniken und Einrichtungen, und die Kosten, die Arbeit und die Fähigkeiten, die erforderlich sind, um sie zu erhalten, beschränken ihren Zugang zu vielen Forschern. Tatsächlich müssen keimfreie Tiere regelmäßig auf eine mögliche Kontamination mit einer Kombination aus Bakterienkultivierungsmethoden, Mikroskopie, Serologie, grober Morphologie und sequenzierungsbasierten Nachweistechniken überwacht werden. Ähnliche Verfahren gelten auch für andere Arten wie Nutztiere, bei denen Tiere im Allgemeinen größer sind und größere Einrichtungen für ihre Zucht und Pflege benötigen, was die Erforschung der Mikrobiota bis zu einem gewissen Grad behindern kann.
Geflügel, genauer gesagt Hühner, sind der Eckpfeiler der weltweiten Tierproduktion, mit einer Herdenpopulation, die 40 Milliarden Vögel pro Jahr überschreiten kann. Es ist die wichtigste Quelle für tierisches Protein in der Welt (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Darüber hinaus gibt es keine kulturellen oder religiösen Tabus, die mit der Aufzucht oder dem Verzehr von Hühnern verbunden sind. Die Geflügeldarmmikrobiota ist wichtig am Wachstum der Tiere, am Futterverwertungsverhältnis, an der Immunität, an der Resistenz gegen Krankheitserreger und an vielen anderen ernährungsphysiologischen, physiologischen oder pathologischen Prozessenbeteiligt 4. Die Erzeugung keimfreier Hühner ist daher unerlässlich, um den Dialog zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt zu unterstreichen4. Selbst wenn mikrobielle Gemeinschaften den Huhneileiter5 bewohnen, ist der Inhalt eines Eies, das von einer gesunden Henne frisch gelegt wurde, meist frei von Mikroorganismen, wobei die Eierschale und die Membranen mechanische Barrieren besitzen, um eine Invasion von Mikroorganismen zu vermeiden4. Darüber hinaus werden Küken in Abwesenheit ihrer Verwandten leicht aufgezogen, was im Gegensatz zu Säugetieren die Produktion keimfreier Tiere ohne elterliche Aufzucht unter sterilen Bedingungen ermöglicht.
Die Versuchsanlage "Infektiologie von Nutztieren, Modellen und Wildtieren" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) ist Teil des französischen nationalen Infrastrukturnetzes EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beherrscht die Produktion von keimfreien Hühnern, um seit mehr als 40 Jahren verschiedene experimentelle Studien durchzuführen 7,8,9,10,11. Diese Tiere wurden aus spezifischen pathogenfreien (SPF) Eiern einer weißen Leghorn-Legelinie hergestellt, die seit den 1970er Jahren in geschlossener Zucht gezüchtet wurde. Hauptsächlich für mikrobiologische Studien verwendet 7,8,9, erleben keimfreie Vögel ein Wiederaufleben des Interesses mit Fragen wie dem Beitrag der Darmmikrobiota zum Verhalten 13, Nährstoffverwertung 14, Immunentwicklung 15 und endokriner Aktivität. Auch wenn einige Studien mit keimfreien Masthähnchenlinien16 veröffentlicht wurden, bleiben diese Studien im Vergleich zu Studien mit experimentellen Schichtlinien unterrepräsentiert. Die Entwicklung wissenschaftlicher Fragen hin zum Crosstalk zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt in Bezug auf Geflügelgesundheit und -wohlergehen hat uns dazu veranlasst, unser historisches Protokoll anzupassen, um keimfreie Masthähnchen der Ross PM3-Linie, der weltweit am häufigsten verwendeten Masthähnchenlinie, herzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">2 mL sterile plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;">Starsted</td>
			<td style="width:119px;">86.1252.001</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BHI agar plates</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">PO1198A</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Brain Heart Infusion broth</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL BHI broth</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hatching incubator</td>
			<td style="width:153px;">Fieme</td>
			<td style="width:119px;">MG 576</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Incubator</td>
			<td style="width:153px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">for bacteriological culture, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Irradiated feed</td>
			<td style="width:153px;">Safe</td>
			<td style="width:119px;">U8983G10R</td>
			<td style="width:389px;">40 kG irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:243px;">Isolators</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Microbiological safety cabinet</td>
			<td style="width:153px;">thermon electron corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: Hera Safe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope Visiscope series 300</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:153px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile sealed boxes</td>
			<td style="width:153px;">Tuperware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterilized glass tube</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">&#34;sovirel&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Thioglycolate Broth with Resazurin</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">90404-500G</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Water bath</td>
			<td style="width:153px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &#176;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Untersuchungen des Beitrags der Darmmikrobiota zur Wirtsphysiologie und Immunkompetenz werden durch die Verfügbarkeit keimfreier Tiermodelle erleichtert, die als Goldstandard gelten. Nistende Vögel sind ideale Modelle für die Produktion keimfreier Tiere, da ihre Verwandten nicht unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden müssen. Keimfreie Hühner werden hauptsächlich aus spezifisch-pathogenfreien (SPF) Versuchslinien erzeugt, die für kommerzielle Hühnerlinien schlecht repräsentativ sind. Die hier vorgeschlagene Methode ermöglichte die Produktion von keimfreien Hühnern aus der schnell wachsenden Masthähnchenlinie Ross PM3, die üblicherweise von der Geflügelindustrie verwendet wird. Die Eier wurden schnell gesammelt, nachdem sie auf einer Masthähnchenzuchtfarm gelegt worden waren. Sie durchliefen einen strengen Dekontaminationsprozess von der Entnahme bis zur Einführung in einen sterilen Eierschlüpfisolator. Die Küken wurden geschlüpft und in diesen sterilen Isolatoren während des Zeitraums gehalten, der zur Kontrolle ihrer Sterilität erforderlich ist. Ursprünglich für eine experimentelle SPF-Linie für weiße Leghorne entwickelt, wurde das vorliegende Protokoll nicht nur an die Ross PM3-Masthähnchenlinie, sondern auch an Wachteln angepasst. Es stellt daher ein robustes und leicht anpassbares Verfahren an andere Geflügelarten und Brutvögel von ökonomischer, biologischer oder ökologischer Relevanz dar.

Sechs Läufe der keimfreien Kükengeneration wurden mit Ross PM3-Eiern aus zwei verschiedenen französischen Betrieben durchgeführt (Tabelle 1). Insgesamt wurden 853 Eier gesammelt und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40% lebensfähig. 490 dieser lebensfähigen Eier durchliefen einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingeführt, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80% entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94% im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der gesammelten Eier.
Die Brutergebnisse variieren jedoch je nach durchgeführter Serie erheblich: von 41,67% bis 88,16% der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Diese Variationen wurden auch zwischen den verschiedenen Luken während desselben Experiments beobachtet. Da nicht alle Isolatoren für alle Durchläufe verwendet wurden, ist es schwierig, einen isolatorabhängigen Effekt auszuschließen. Dieser Chargeneffekt korrelierte jedoch direkt mit dem Alter der Legehennen (Abbildung 1), wo Eier von älteren Hühnern weniger lebensfähig waren.
Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt. Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bestätigt, dass die Tiere aus 14 der 16 Isolatoren keimfrei sind. Dies entspricht einer Erfolgsquote von 87,5%. Die beiden verbleibenden Isolatoren waren durch ein einziges umweltbedingtes und nichtpathogenes Bakterium kontaminiert.
Alle Tiere, die für die wissenschaftlichen Experimente verwendet wurden, blieben bis zum Ende der Studien für mindestens drei Wochen nach dem Schlüpfen keimfrei.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Einfluss des Hühneralters auf die Schlüpfrate Die vorliegende Abbildung zeigt die beobachteten Schlupfraten auf der Grundlage des Alters der Legehennenherde, ausgedrückt in Wochen des Legens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Gesammelte Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier/gesammelte Eier</td>
			<td>Eier, die in Isolator 1 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 2 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 3 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 4 überführt werden</td>
			<td>Gesamtzahl der übertragenen Eier</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 1 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 2 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 3 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 4 geschlüpft sind</td>
			<td>Gesamtzahl der lebensfähigen geschlüpften Küken</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier1</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier2</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier3</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier4</td>
			<td c="">lebensfähige geschlüpfte/transferierte Eier weltweit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamt</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Technische Ergebnisse der verschiedenen Schraffurexperimente. Die vorliegende Tabelle zeigt die Ergebnisse der 6 durchgeführten Serien keimfreier Schlupflöcher: Anzahl der gesammelten Eier, Lebensfähigkeit des Embryos nach 19 Tagen und lebensfähige geschlüpfte Küken in den verschiedenen Isolatoren.

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Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Aufrufe.  INRAE, PFIE, UE-1277. Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Serie: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Die Beurteilung der Leber metabolischen Veränderungen während Progressive Colonization von Keimfrei Maus durch 1 H-NMR-Spektroskopie

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Zusammenfassung

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