Yazarlar, döllenmiş yumurta temini için yetiştiricilere ve Boyé accouvage topluluğuna (La Boissière en Gâtine, Fransa) minnettardır. Bu çalışma, Fransa'daki Région Centre Val de Loire tarafından finanse edilen APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) araştırma konsorsiyumunun himayesinde gerçekleştirilmiştir.

Hayvan bakım prosedürleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (86/609/EEC) ve hayvan deneylerine ilişkin Fransız yönetmelikleri tarafından belirlenen kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İzolatör preparatı
<ol><li>Gerekli malzemeleri pozitif basınç altında sert bir izolatöre yerleştirin: 50 mL tüpler, 5, 10 ve 25 mL plastik pipetler, ışınlanmış besleme, otoklavlanmış su ve steril sızdırmaz plastik kaplar.</li>
	<li>Transfer mikrop öldürücü tuzağı% 2'lik bir kuaterner amonyum çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Metreküp(m3) başına 30 g potasyum permanganata ilave edilen 60 mL formalin (% 24 formaldehit) kullanarak izolatörün formaldehit buharı ile üç kez sterilize edilmesi. Tüm temas yüzeylerinin sterilizasyonunu sağlamak için izolatör içindeki malzemeleri her sterilizasyon arasında hareket ettirin.</li>
	<li>Yumurtaları sokmadan önce izolatör sıcaklığını en az 2 gün boyunca 37 ° C'ye ayarlayın. Higrometreyi, giriş gününde bağıl nemin% 65-70'ine (RH) ayarlayın.</li>
</ol>2. Yumurta toplama ve kuluçka
<ol><li>Yumurtaları, yumurtlayan tavukların iyi bir kuluçka oranına (yumurta üretiminin zirvesinde en az% 80) ve iyi sıhhi durumlarına (yani, yaygın kümes hayvanı patojenlerinin yokluğu ve sürü içinde hastalıkların yokluğu) dayanarak seçilen çiftliklerden toplayın. Koşu bandında görsel olarak temiz ve kusursuz yumurtalar seçin.</li>
	<li>Yumurta yüzeyini, oda sıcaklığında% 1.5'lik bir perasetik asit çözeltisine 5 dakika batırarak derhal dekontamine edin.</li>
	<li>Formaldehit buharı ile dekontamine edilmiş bir kutu kullanarak yumurtaları deney tesisine taşıyın.</li>
	<li>Yumurtaları 4 °C'de 24 saat saklayın. Adım 2.2'de açıklanan dekontaminasyon işlemini tekrarlayın ve 19 gün boyunca kuluçkalık bir inkübatöre (Gün 0) yerleştirin.</li>
</ol>3. Kuluçka
<ol><li>19. Günde, doğurganlığı, canlılığı (hareketliliği) ve embriyo gelişimini, steril koşullar altında hafif bir yumurta mum makinesi kullanarak konserve ederek doğrulayın. Steril kuluçkalık izolatörlere sadece canlı embriyonlanmış yumurtaları sürün.</li>
	<li>Seçilen yumurtaları, 30 s boyunca% 1.5 perasetik asit çözeltisi püskürterek veya her yumurtanın tüm yüzeyi kaplanana kadar dekontamine edin. Yumurtalar, izolatörlere transfer sırasında 16 dakika ve 30 s boyunca spreyle temas halinde kalacaktır.</li>
	<li>Yumurtaları steril kuluçka izolatörlerine aktarın ve kuluçka boşluğuna yerleştirmeden önce steril demineralize su ile durulayın. NOT: Hayvanlar yumurtadan çıkar ve steril izolatörlerde yetiştirilir. Gama ışınlaması ile sterilize edilmiş ticari bir diyetle ad libitum ile beslenirler ve su dağıtıcıları tarafından sağlanan otoklavlanmış musluk suyuyla sulanırlar.</li>
</ol>4. Bakteriyolojik durum analizi
<ol><li>Yumurtadan çıktıktan bir gün sonra, doğrudan farklı civcivlerin rektumundan bir dışkı örneği alın ve bu numuneyi belirli bir izolatör içindeki tüm hayvanları temsil etmek için sterilize edilmiş bir cam tüp içinde toplayın.</li>
	<li>Dışkı örnekleri az ya da çok sıvı olduğundan, resazurin ile 9 mL tiyoglikolat et suyuna 1 mL dışkı eşdeğeri ekleyin. Kalan dışkı örneğini 9 mL beyin kalp infüzyonu suyuna (BHI) ekleyin ve tüpleri 18 ila 48 saat boyunca sallamadan 37 ° C'de inkübe edin. Bu, çok çeşitli aerobik, fakültatif aerobik ve titiz olmayan anaerobik türlerin büyümesine izin verecektir. NOT: Resizmarinli tioglikolat et suyu, titiz olmayan anaerobik bakterilerin tespiti için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda aerobik bakterilerin tespitini de sağlar. Bu ortam, sterilite testi için Avrupa, Amerika ve Japon farmakopelerine uygundur18,19,20.</li>
	<li>Büyüme ortamındaki herhangi bir değişikliğin 18 saatlik inkübasyondan sonra meydana gelip gelmediğini görsel olarak gözlemleyin. 48 saat sonra, BHI dışkı-et suyu ortamından bir damla alın, bir cam slayta yerleştirin ve bakterilerin yokluğu veya varlığı için mikroskop altında (40X büyütme) gözlemleyin.</li>
	<li>Bakterilerin varlığına dair bir şüphe varsa, BHI kültüründen bir örnek alın ve BHI agar plakalarına tohumlayın. 18 ila 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Koloniler varsa, hassas mikrobiyal tanımlama için MALDI-TOF kütle spektrometresi gibi yüksek verimli teknikler uygulayın. NOT: 72 saat sonra, bakteriyolojik analizler negatifse, hayvanlar mikropsuz ilan edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology.">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li><li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system.">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li><li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fern&#225;ndez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota,+gut+health+and+chicken+productivity:+what+is+the+connection?.">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?.</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota.">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).</li><li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg:+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation.">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li><li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens.">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li><li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+(type+1)+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli.">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li><li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides,+which+improves+intestinal+colonization.">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li><li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Br&#233;e, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain.">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).</li><li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+(Coturnix+japonica).">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li><li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens.">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li><li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens.">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).</li><li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken.">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li><li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , (2009).</li><li>Japanese Pharmacopoeia, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , (2009).</li><li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), (2008).</li><li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+chicks:+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods.">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li><li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick.">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens.">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Mikropsuz tavuklar üretmek için çeşitli yöntemler daha önce tanımlanmıştır 7,21,22. Burada sunulanlar gibi basit yöntemler, yumurta yüzeyindeki ve izolatörlerdeki bakteri yükünü azaltmak için farklı dezenfektanlar kullanır. En sık kullanılan dezenfektanlar merkürik klorür, kuaterner amonyum, iyodoform, sodyum hipoklorit ve klor dioksit çözeltileridir. Sonuçlar genellikle tatmin edicidir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin erişilebilirliğine rağmen, az sayıda yapı yöntemi uygulayabilir ve hayvanları büyük ölçekte yetiştirebilir, böylece mikropsuz tavukların kullanımını, yalnızca çok özel bilimsel soruları ele almak için kullanılan, nispeten nadir bir yaklaşım haline getirir. Burada açıklanan yöntemler, malzemeler ve ekipmanlar, en az 3 hafta boyunca sağlıklı ve steril kalan mikropsuz piliçlerin yüksek verimli bir kuluçka oranına izin verir (üretildikleri bilimsel deneylerin süresi).
Sonuçlar, protokolün ticari kanatlı hayvan çiftliklerinde toplanan yumurtalardan mikropsuz civcivlerin üretimine uyarlanmasının başarılı olduğunu göstermektedir. SPF yumurta üretimi ile ilgili deneyimler, kuluçka verimliliğinin öncelikle yumurtlayan tavukların yaşına ve toplanan yumurtaların kalitesine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Çiftlikler seçildiğinde ve yumurtalar toplanırken her iki parametre de dikkate alınmıştır. Aynı yöntemi kullanarak, mikropsuz piliçlerin ortalama kuluçka oranı, tesisimizdeki SPF yumurtlayan tavukların son üretiminde elde edilenden (% 79'a karşı% 35), hayvan sterilitesini etkilemeden (% 87'ye karşı% 83) elde edilenden çok daha iyidir. Bu farklılıklar, kuşların genetik arka planıyla (piliçlere karşı katmanlar) ve SPF hayvanlarının yumurtalarında daha kırılgan olması muhtemel olan yumurta kabuğunun kalitesiyle ilişkili olabilir. Ayrıca, 2 saatten fazla (çiftliklerden deney tesisine) taşımanın kuluçka verimliliğini ve kalitesini etkilemediğini de gösteriyoruz.
Kuluçkalık izolatörler için kullanılan sterilizasyon işlemi ve yumurta dekontaminasyonu protokolü optimize edilmiş olmasına rağmen, izolatörlerin yaklaşık% 10'u mikropsuz değildi. Kontaminasyonun kökenini anlamak için, yumurtadan çıkan izolatörlerin yumurta girişinden önce rutin sterilite kontrolünün yapılması çok önemlidir.
Kuşların sterilite durumu ile ilgili olarak, dışkı örneklerinden aerobik ve titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesine izin veren yöntemleri uygulamaya çalıştık, böylece canlı, canlı bakterileri tespit ettiğimizi sağladık. Bu yöntemler, sterilite testi için uluslararası farmakopelerle uyumludur ve rutin olarak kullanılacak hızlı, kolay ve maliyeti düşük teknikleri temsil eder. Bununla birlikte, 16S rRNA gen dizilimi gibi moleküler biyoloji teknikleri, bakteri canlılığı hakkında bilgi vermemekle birlikte, yetiştirilemeyen bakterilerin varlığının doğrulanması için uygulanabilir. Nitekim, yakın zamanda yapılan bir çalışma, maternal yumurta kanalı mikrobiyotasının bazı bakterilerinin yumurta akı yoluyla embriyoya aktarıldığını ve daha sonra embriyo bağırsak bakteri popülasyonunun çoğunu oluşturduğunu ileri sürmüştür5. Dahası, başka bir çalışma, erken embriyolarda barındırılan mikrobiyal kolonizatörlerin bir kısmının maternal tavuklardan miras alındığını ve bağırsak mikrobiyal bolluğunun ve çeşitliliğinin daha sonra gelişim sırasında çevresel faktörlerden ve konakçı genetiğinden etkilendiğini ileri sürdü23. Bununla birlikte, bu çalışmaların sonuçları, bu bakterilerin büyük bir kısmının yumurta akında (büyük ölçüde antimikrobiyal moleküllerle yüklü) ölü olabileceği veya çoğalamayacağı DNA dizi analizine dayanmaktadır. Thomas ve işbirlikçileri16 , BHI plakalarına dışkı damlatma yoluyla yetiştirilebilir aerobik ve fakültatif aerobik bakterilerin değerlendirilmesi yoluyla sterilite testi gerçekleştirdi ve böylece mikropsuz sterilite kontrolü için standart bakteriyolojik yöntemlerin verimliliğini vurguladı. Ayrıca, önerilen protokolde, titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesini tespit edebilmek için resazurin ile tiyoglikolat et suyunda büyüme izlemeyi kullandık.
Mikropsuz bıldırcınların ve tavukların üretimi için zaten kullanılan protokol, çoğu yuva yapan kuştan mikropsuz hayvanların üretimine uyarlanabilir ve bu hayvanların fizyolojisine mikrobiyota katkısının incelenmesi için perspektifler sunar. Bu modelin kümes hayvanı bağırsağındaki konakçı-mikrobiyota karşılıklı etkileşimlerini araştırmak için kullanılmasının yanı sıra, uygulamalı araştırmalar için de yararlı olabilir. Örneğin, hayvan sağlığını ve sağlamlığını iyileştirmek için tavuk bağırsağı komensal mikroorganizmalarından türetilen probiyotiklerin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bağırsak mikrobiyotasının hayvan sağlığına katkısı ile ilgili bilimsel ve popüler ilgide çarpıcı bir artış olmuştur. Hayvanın bağırsağında farklı nişlerde yaşayan bakteri, virüs, mantar ve arkelerden oluşan mikrobiyota, sadece memeli türlerini değil, aynı zamanda kümes hayvanları gibi hayvancılığı da etkileyen enflamatuar, bulaşıcı ve metabolik hastalıkların düzenlenmesinde doğrudan veya dolaylı olarak rol oynar1. Bağırsak mikrobiyotasının sağlık ve hastalığa katkısını daha iyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, mikropsuz ve gnotobiyotik hayvanlar, sırasıyla mikropların veya bilinen bir mikrobiyotanın tamamen yokluğunun, enfeksiyonların fizyopatolojisi üzerinde incelenmesine izin verir 2,3. Bununla birlikte, bu hayvanları üretmek ve sürdürmek, özel teknikler ve tesisler gerektirir ve onları korumak için gereken maliyetler, emek ve beceriler birçok araştırmacıya erişimlerini sınırlar. Gerçekten de, mikropsuz hayvanlar, bakteri yetiştirme yöntemleri, mikroskopi, seroloji, brüt morfoloji ve dizileme tabanlı tespit tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak olası kontaminasyon için düzenli olarak izlenmelidir. Benzer prosedürler, hayvanların genellikle daha büyük olduğu ve üreme ve bakımları için daha büyük tesisler gerektirdiği hayvancılık gibi diğer türler için de geçerlidir, bu da mikrobiyota üzerine araştırmaları bir dereceye kadar engelleyebilir.
Kümes hayvanları, daha spesifik olarak tavuklar, yılda 40 milyar kuşu aşabilen bir sürü nüfusu ile dünya çapında hayvancılık üretiminin temel taşıdır. Dünyadaki en önemli hayvansal protein kaynağıdır (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Dahası, tavukların yetiştirilmesi veya tüketilmesiyle ilgili kültürel veya dini tabular yoktur. Kanatlı hayvan bağırsak mikrobiyotası, diğer birçok besinsel, fizyolojik veya patolojik sürecin yanı sıra hayvanın büyümesinde, yem dönüşüm oranında, bağışıklığında, patojen direncinde önemli rol oynar4. Bu nedenle, mikrobiyota ve ev sahibi4 arasındaki diyaloğun altını çizmek için mikropsuz tavukların nesli vazgeçilmezdir. Mikrobiyal topluluklar tavuk yumurta kanalı5'te yaşıyor olsa bile, sağlıklı bir tavuk tarafından taze olarak serilmiş bir yumurtanın içeriği çoğunlukla mikroorganizmalardan arındırılmıştır, yumurta kabuğu ve mikroorganizma istilasını önlemek için mekanik bariyerlere sahip zarlar4. Ek olarak, civcivler, memelilerin aksine, steril koşullar altında ebeveyn yetiştiriciliği olmadan mikropsuz hayvanların üretilmesine izin veren akrabalarının yokluğunda kolayca yetiştirilir.
"Çiftlik, Model ve Vahşi Hayvanların Enfeksiyonu" deneysel tesisi (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Fransa, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12), Fransız Ulusal Altyapı Ağı EMERG'IN'in (https://www.emergin.fr/) bir parçasıdır. PFIE, 40 yıldan fazla bir süredir çeşitli deneysel çalışmalar yapmak için mikropsuz tavukların üretiminde ustalaşmıştır 7,8,9,10,11. Bu hayvanlar, 1970'lerden beri kapalı ıslahta yetiştirilen beyaz bir bacak boynuzu döşeme hattından spesifik patojensiz (SPF) yumurtalardan üretilmiştir. Esas olarak mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılan 7,8,9 mikropsuz kuşlar, bağırsak mikrobiyotasının davranışa katkısı 13, besin kullanımı 14, bağışıklık gelişimi15 ve endokrin aktivite gibi sorularla ilginin yeniden canlandığını yaşamaktadır. Mikropsuz piliç hatları16 kullanılarak bazı çalışmalar yayınlanmış olsa bile, bu çalışmalar deneysel katman çizgileri kullanan çalışmalara kıyasla yeterince temsil edilmemektedir. Mikrobiyota ile kümes hayvanı sağlığı ve refahındaki ev sahibi arasındaki çapraz konuşmaya yönelik bilimsel soruların evrimi, tarihsel protokolümüzü, dünyanın en çok kullanılan piliç tavuğu hattı olan Ross PM3 hattının mikropsuz piliçlerini üretmek için uyarlamamıza yol açtı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">2 mL sterile plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;">Starsted</td>
			<td style="width:119px;">86.1252.001</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BHI agar plates</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">PO1198A</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Brain Heart Infusion broth</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL BHI broth</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hatching incubator</td>
			<td style="width:153px;">Fieme</td>
			<td style="width:119px;">MG 576</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Incubator</td>
			<td style="width:153px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">for bacteriological culture, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Irradiated feed</td>
			<td style="width:153px;">Safe</td>
			<td style="width:119px;">U8983G10R</td>
			<td style="width:389px;">40 kG irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:243px;">Isolators</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Microbiological safety cabinet</td>
			<td style="width:153px;">thermon electron corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: Hera Safe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope Visiscope series 300</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:153px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile sealed boxes</td>
			<td style="width:153px;">Tuperware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterilized glass tube</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">&#34;sovirel&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Thioglycolate Broth with Resazurin</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">90404-500G</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Water bath</td>
			<td style="width:153px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &#176;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Bağırsak mikrobiyotasının konakçı fizyolojisine ve immün yeterliliğine katkısı üzerine yapılan çalışmalar, altın standart olarak kabul edilen mikropsuz hayvan modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılmaktadır. Yuvalama kuşları, mikropsuz hayvanların üretimi için ideal modellerdir, çünkü akrabalarını steril koşullar altında yetiştirmeye gerek yoktur. Mikropsuz tavuklar esas olarak, ticari tavuk hatlarını zayıf bir şekilde temsil eden spesifik patojensiz (SPF) deney hatlarından üretilir. Burada önerilen yöntem, kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaygın olarak kullanılan hızlı büyüyen piliç hattı Ross PM3'ten mikropsuz tavukların üretilmesine izin verdi. Bir piliç yetiştiricisi çiftliğine döşendikten sonra yumurtalar hızla toplandı. Toplamadan steril bir yumurtadan çıkma izolatörüne girmeye kadar sıkı bir dekontaminasyon işlemine tabi tutuldular. Civcivler yumurtadan çıkmış ve sterilitelerini kontrol etmek için gerekli olan süre boyunca bu steril izolatörlerde tutulmuştur. Başlangıçta deneysel bir SPF beyaz bacak boynuzu hattı için geliştirilen mevcut protokol sadece Ross PM3 piliç hattına değil, aynı zamanda bıldırcınlara da uyarlanmıştır. Bu nedenle, diğer kanatlı hayvan türlerine ve ekonomik, biyolojik veya ekolojik açıdan yuva yapan kuşlara karşı sağlam ve kolayca uyarlanabilir bir prosedürü temsil eder.

İki farklı Fransız çiftliğinden gelen Ross PM3 yumurtaları ile altı adet mikropsuz civciv üretimi gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Toplam 853 yumurta toplandı ve iki dekontaminasyon adımından ve 19 günlük inkübasyondan sonra% 86.40'ı yaşayabilirdi. Bu canlı yumurtaların 490'ı üçüncü bir dekontaminasyon adımına tabi tutuldu ve ortalama% 79.80'lik bir kuluçka oranı için çeşitli kuluçka izolatörlerine sokuldu. Bu, toplanan ilk yumurta sayısına kıyasla% 68.94'lük bir kuluçka oranını temsil eder.
Bununla birlikte, kuluçka sonuçları, gerçekleştirilen seriye göre önemli ölçüde değişmektedir: toplanan yumurta sayısına kıyasla canlı civcivlerin% 41.67 ila% 88.16'sı. Bu varyasyonlar, aynı deney sırasında farklı kapaklar arasında da gözlendi. Tüm izolatörler tüm koşular için kullanılmadığından, izolatöre bağımlı bir etkiyi dışlamak zordur. Bununla birlikte, bu parti etkisi, yaşlı tavuklardan gelen yumurtaların daha az canlı olduğu yumurtlayan tavukların yaşı ile doğrudan ilişkiliydi (Şekil 1).
Altı çalışma, dört farklı kuluçkalık izolatör kullanılarak gerçekleştirildi. Bakteriyolojik kontrolden sonra, 16 izolatörün 14'ünden gelen hayvanların mikropsuz olduğu doğrulandı. Bu da %87,5'lik bir başarı oranına tekabül etmektedir. Kalan iki izolatör, tek bir çevresel ve patojenik olmayan bakteri tarafından kontamine edildi.
Bilimsel deneyler için kullanılan tüm hayvanlar, çalışmaların sonuna kadar, yumurtadan çıktıktan sonra en az üç hafta boyunca mikropsuz kaldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Resim 1: Tavuk yaşının kuluçka hızına etkisi Mevcut rakam, yumurtlama haftalarıyla ifade edilen yumurtlayan tavuk sürüsünün yaşına göre gözlemlenen kuluçka oranlarını vurgulamaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Toplanan yumurtalar</td>
			<td>D19 canlı yumurta</td>
			<td>D19 canlı yumurta/toplanan yumurtalar</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 1</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 2</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 3</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 4</td>
			<td>transfer edilen yumurtaların toplamı</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 1</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 2</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 3</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 4</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkmış civcivlerin toplamı</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör1</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör2</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör3</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör4</td>
			<td c="">küresel olarak canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurtalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koş 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Farklı kuluçka deneylerinin teknik sonuçları. Bu tablo, gerçekleştirilen 6 seri mikropsuz kuluçkalamanın sonuçlarını vurgulamaktadır: toplanan yumurta sayısı, embriyonun 19 günde yaşayabilirliği ve çeşitli izolatörlerde canlı yumurtadan çıkmış civcivler.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies at JoVE.com

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Görüntüleme.  INRAE, PFIE, UE-1277. Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Video: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler