Gli autori sono grati agli allevatori e alla società Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Francia) per la fornitura di uova fecondate. Questo studio è stato condotto sotto l'egida del consorzio di ricerca APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), finanziato dal Région Centre Val de Loire, Francia.

Le procedure di cura degli animali sono state eseguite conformemente alle linee guida stabilite dalla direttiva del Consiglio delle Comunità europee (86/609/CEE) e dai regolamenti francesi sulla sperimentazione animale.
1. Preparazione dell'isolatore
<ol><li>Inserire i materiali necessari in un isolatore rigido a pressione positiva: tubi da 50 ml, pipette di plastica da 5, 10 e 25 ml, alimentazione irradiata, acqua autoclavata e contenitori di plastica sigillati sterili.</li>
	<li>Riempire la trappola germicida di trasferimento con una soluzione di ammonio quaternario al 2%.</li>
	<li>Sterilizzare l'isolatore tre volte con vapore di formaldeide utilizzando 60 ml di formalina (24% formaldeide) aggiunti a 30 g di permanganato di potassio per metro cubo (m3). Spostare i materiali all'interno dell'isolatore tra una sterilizzazione e l'altra per garantire la sterilizzazione di tutte le superfici di contatto.</li>
	<li>Impostare la temperatura dell'isolatore a 37 °C per almeno 2 giorni prima di introdurre le uova. Impostare l'igrometro al 65-70% di umidità relativa (RH) il giorno dell'introduzione.</li>
</ol>2. Raccolta e incubazione delle uova
<ol><li>Raccogliere le uova provenienti da allevamenti selezionati sulla base di un buon tasso di schiusa delle galline ovaiole (almeno l'80% al picco della produzione di uova) e del loro buono stato sanitario (cioè assenza di comuni agenti patogeni del pollame e assenza di malattie all'interno del gregge). Seleziona visivamente uova pulite e impeccabili sul tapis roulant.</li>
	<li>Decontaminare immediatamente la superficie dell'uovo immergendole per 5 minuti in una soluzione di acido peracetico all'1,5% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasportare le uova alla struttura sperimentale utilizzando una scatola decontaminata con vapore di formaldeide.</li>
	<li>Conservare le uova per 24 ore a 4 °C. Ripetere il processo di decontaminazione descritto nel passaggio 2.2 e metterli in un incubatore da cova (Giorno 0) per 19 giorni.</li>
</ol>3. Schiusa
<ol><li>Il giorno 19, verificare la fertilità, la vitalità (motilità) e lo sviluppo dell'embrione candificandoli usando un leggero candler di uova in condizioni sterili. Introdurre solo uova embrionate vive negli isolatori sterili da cova.</li>
	<li>Decontaminare le uova selezionate spruzzando una soluzione di acido peracetico all'1,5% per 30 s o fino a coprire l'intera superficie di ciascun uovo. Le uova rimarranno a contatto con lo spray per 16 minuti e 30 secondi durante il trasferimento in isolatori.</li>
	<li>Trasferire le uova negli isolatori sterili da cova e sciacquarle con acqua demineralizzata sterile prima di metterle nello spazio di schiusa. NOTA: Gli animali vengono schiusi e allevati in isolatori sterili. Sono alimentati ad libitum con una dieta commerciale sterilizzata mediante irradiazione gamma e annaffiati con acqua di rubinetto autoclavata fornita da distributori d'acqua.</li>
</ol>4. Analisi dello stato batteriologico
<ol><li>Un giorno dopo la schiusa, prelevare un campione fecale direttamente dal retto di diversi pulcini e raggrupparli in una provetta di vetro sterilizzata per rendere questo campione rappresentativo di tutti gli animali all'interno di un determinato isolatore.</li>
	<li>I campioni fecali essendo più o meno liquidi, aggiungere un equivalente di 1 mL di feci a 9 mL di brodo di tioglicolato con resazurina. Aggiungere il campione fecale rimanente a 9 ml di brodo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) e incubare le provette a 37 °C senza agitare per 18-48 ore. Ciò consentirà la crescita di una vasta gamma di specie anaerobiche aerobiche, facoltative e non fastidious. NOTA: Il brodo di tioglicolato con resazurina è destinato alla rilevazione di batteri anaerobici nonfastidi ma consente anche il rilevamento di batteri aerobici. Questo mezzo è conforme alle farmacopee europee, americane e giapponesi per i test di sterilità 18,19,20.</li>
	<li>Osservare visivamente se si verificano modifiche nei mezzi di crescita dopo 18 ore di incubazione. Dopo 48 ore, prendere una goccia dal mezzo di brodo fecale BHI, posizionarla su un vetrino e osservare al microscopio (ingrandimento 40X) per l'assenza o la presenza di batteri.</li>
	<li>Se c'è un sospetto sulla presenza di batteri, prelevare un campione dalla coltura BHI e seminarlo su piastre di agar BHI. Incubare a 37 °C per 18-48 ore.</li>
	<li>Se sono presenti colonie, eseguire tecniche ad alto rendimento come la spettrometria di massa MALDI-TOF per una precisa identificazione microbica. NOTA: Dopo 72 h, se le analisi batteriologiche sono negative, gli animali sono dichiarati privi di germi.</li>
</ol>

<ol>
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J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diversi metodi per generare polli privi di germi sono stati precedentemente descritti 7,21,22. Metodi semplici, come quello qui presentato, utilizzano diversi disinfettanti per ridurre la carica batterica nella superficie dell'uovo e negli isolatori. I disinfettanti più comunemente usati sono cloruro mercurico, ammonio quaternario, iodoformio, ipoclorito di sodio e soluzioni di biossido di cloro. I risultati sono spesso soddisfacenti. Tuttavia, nonostante l'accessibilità di questi metodi, poche strutture possono applicare il metodo e allevare gli animali su larga scala, rendendo così l'utilizzo di polli privi di germi un approccio relativamente raro, utilizzato solo per affrontare questioni scientifiche molto specifiche. I metodi, i materiali e le attrezzature qui descritti consentono una percentuale di schiusa altamente efficiente di polli da carne privi di germi, che rimangono sani e sterili per almeno 3 settimane (la durata degli esperimenti scientifici a cui sono stati prodotti).
I risultati mostrano che l'adattamento del protocollo alla produzione di pulcini privi di germi da uova raccolte in allevamenti di pollame commerciali ha successo. L'esperienza con la produzione di uova SPF rivela che l'efficienza della schiusa dipende principalmente dall'età delle galline ovaiole e dalla qualità delle uova raccolte. Entrambi i parametri sono stati presi in considerazione quando sono stati scelti gli allevamenti e le uova raccolte. Utilizzando lo stesso metodo, il tasso medio di schiusa dei polli da carne privi di germi è molto migliore di quello ottenuto nell'ultima produzione di galline ovaiole SPF presso il nostro stabilimento (79% vs 35%), senza influire sulla sterilità degli animali (87% vs 83%). Queste differenze possono essere associate al background genetico degli uccelli (polli da carne contro strati) e alla qualità del guscio d'uovo, che è probabile che sia più fragile nelle uova degli animali SPF, tenuti in allevamento chiuso per più di 40 anni. Inoltre, mostriamo anche che il trasporto di più di 2 ore (dalle fattorie alla struttura sperimentale) non influisce sull'efficienza e sulla qualità della schiusa.
Sebbene il processo di sterilizzazione utilizzato per gli isolatori da cova e il protocollo per la decontaminazione delle uova siano stati ottimizzati, circa il 10% degli isolatori non era privo di germi. Per comprendere l'origine della contaminazione, è molto importante effettuare il controllo di routine della sterilità degli isolatori nati prima dell'introduzione delle uova.
Per quanto riguarda lo stato di sterilità degli uccelli, abbiamo cercato di applicare metodi che consentano la crescita di batteri anaerobici aerobici e nonfastidi da campioni fecali, assicurando così che stiamo rilevando batteri vivi e vitali. Questi metodi sono conformi alle farmacopee internazionali per i test di sterilità e rappresentano tecniche rapide, facili e a costi ridotti da utilizzare abitualmente. Tuttavia, tecniche di biologia molecolare come il sequenziamento del gene rRNA 16S, sebbene non forniscano informazioni sulla vitalità dei batteri, possono essere applicate per la conferma della presenza di batteri non coltivabili. In effetti, uno studio recente ha suggerito che alcuni batteri del microbiota dell'ovidotto materno sembrano essere trasferiti all'embrione attraverso l'albume, costituendo in seguito la maggior parte della popolazione batterica intestinale dell'embrione5. Inoltre, un altro studio ha suggerito che parte dei colonizzatori microbici ospitati nei primi embrioni sono stati ereditati dalle galline materne e l'abbondanza e la diversità microbica intestinale sono state successivamente influenzate da fattori ambientali e genetica dell'ospite durante lo sviluppo23. Tuttavia, i risultati di questi studi si basano sull'analisi della sequenza del DNA, in cui un gran numero di questi batteri potrebbe essere morto o non replicabile nell'albume d'uovo (notevolmente caricato con molecole antimicrobiche). Thomas e collaboratori16 hanno eseguito test di sterilità attraverso la valutazione di batteri aerobici e facoltativi coltivabili attraverso la caduta fecale su piastre BHI, evidenziando così l'efficienza dei metodi batteriologici standard per il controllo della sterilità priva di germi. Inoltre, nel protocollo proposto, abbiamo utilizzato il monitoraggio della crescita in brodo di tioglicolato con resazurina per essere in grado di rilevare la crescita di batteri anaerobici nonfastidi.
Già utilizzato per la produzione di quaglie e polli privi di germi, il protocollo è adattabile alla produzione di animali privi di germi dalla maggior parte degli uccelli nidificanti e offre prospettive per lo studio del contributo del microbiota alla fisiologia di questi animali. Oltre all'uso di questo modello per studiare le interazioni reciproche ospite-microbiota nell'intestino del pollame, potrebbe anche essere utile per la ricerca applicata. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato per valutare la sicurezza e l'efficacia dei probiotici derivati da microrganismi commensali dell'intestino di pollo per migliorare la salute e la robustezza degli animali.

C'è stato un drammatico aumento dell'interesse scientifico e popolare per quanto riguarda il contributo del microbiota intestinale alla salute degli animali. Il microbiota, costituito da batteri, virus, funghi e archei che abitano diverse nicchie nell'intestino dell'animale, è implicato direttamente o indirettamente nella regolazione di malattie infiammatorie, infettive e metaboliche che colpiscono non solo le specie di mammiferi ma anche il bestiame, come il pollame1. Sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare meglio il contributo del microbiota intestinale alla salute e alla malattia. Ad esempio, gli animali privi di germi e gnotobiotici consentono lo studio della completa assenza di microbi o di un microbiota noto, rispettivamente, sulla fisiopatologia delle infezioni 2,3. Tuttavia, la generazione e il mantenimento di questi animali richiede tecniche e strutture specializzate e i costi, la manodopera e le competenze necessarie per mantenerli limitano il loro accesso a molti ricercatori. In effetti, gli animali privi di germi devono essere monitorati regolarmente per possibili contaminazioni utilizzando una combinazione di metodi di coltivazione batterica, microscopia, sierologia, morfologia grossolana e tecniche di rilevamento basate sul sequenziamento. Procedure simili si applicano anche ad altre specie, come il bestiame, dove gli animali sono generalmente più grandi e richiedono strutture più grandi per il loro allevamento e mantenimento, il che può ostacolare, in una certa misura, la ricerca sul microbiota.
Il pollame, in particolare i polli, è la pietra angolare della produzione zootecnica in tutto il mondo, con una popolazione di gregge che può superare i 40 miliardi di uccelli all'anno. È la più importante fonte di proteine animali al mondo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Inoltre, non ci sono tabù culturali o religiosi associati all'allevamento o al consumo di polli. Il microbiota intestinale del pollame è coinvolto in modo importante nella crescita degli animali, nel rapporto di conversione del mangime, nell'immunità, nella resistenza agli agenti patogeni, tra molti altri processi nutrizionali, fisiologici o patologici4. La generazione di polli privi di germi è quindi indispensabile per sottolineare il dialogo tra il microbiota e il suo ospite4. Anche se le comunità microbiche abitano l'ovidottodi pollo 5, il contenuto di un uovo appena deposto da una gallina sana è per lo più privo di microrganismi, il guscio d'uovo e le membrane possiedono barriere meccaniche per evitare l'invasione di microrganismi4. Inoltre, i pulcini sono facilmente allevati in assenza dei loro parenti, il che, a differenza dei mammiferi, consente la produzione di animali privi di germi senza l'allevamento dei genitori in condizioni sterili.
La struttura sperimentale "Infettivologia dell'allevamento, del modello e degli animali selvatici" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Francia, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) fa parte della rete infrastrutturale nazionale francese EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE ha padroneggiato la produzione di polli privi di germi per eseguire vari studi sperimentali per più di 40 anni 7,8,9,10,11. Questi animali sono stati prodotti da uova specifiche prive di agenti patogeni (SPF) da una linea di deposizione livorno bianca allevate in allevamento chiuso dal 1970. Utilizzato principalmente per studi microbiologici 7,8,9, gli uccelli privi di germi stanno vivendo una rinascita di interesse con domande come il contributo del microbiota intestinale al comportamento13, l'utilizzo dei nutrienti14, lo sviluppo immunitario15 e l'attività endocrina. Anche se alcuni studi sono stati pubblicati utilizzando linee di polli da carne prive di germi16, questi studi rimangono sottorappresentati rispetto agli studi che utilizzano linee di strati sperimentali. L'evoluzione delle questioni scientifiche verso la diafonia tra il microbiota e il suo ospite nella salute e nel benessere del pollame ci ha portato ad adattare il nostro protocollo storico per produrre polli da carne privi di germi della linea Ross PM3, la linea di polli da carne più utilizzata al mondo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">2 mL sterile plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;">Starsted</td>
			<td style="width:119px;">86.1252.001</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BHI agar plates</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">PO1198A</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Brain Heart Infusion broth</td>
			<td style="width:153px;">Thermo fisher diagnostic</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL BHI broth</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hatching incubator</td>
			<td style="width:153px;">Fieme</td>
			<td style="width:119px;">MG 576</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Incubator</td>
			<td style="width:153px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">for bacteriological culture, 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Irradiated feed</td>
			<td style="width:153px;">Safe</td>
			<td style="width:119px;">U8983G10R</td>
			<td style="width:389px;">40 kG irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:243px;">Isolators</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Microbiological safety cabinet</td>
			<td style="width:153px;">thermon electron corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: Hera Safe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope Visiscope series 300</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:153px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Plastic pipettes</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile sealed boxes</td>
			<td style="width:153px;">Tuperware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterilized glass tube</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">&#34;sovirel&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Thioglycolate Broth with Resazurin</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">90404-500G</td>
			<td style="width:389px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Water bath</td>
			<td style="width:153px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:389px;">model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &#176;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Gli studi sul contributo del microbiota intestinale alla fisiologia e all'immunocompetenza dell'ospite sono facilitati dalla disponibilità di modelli animali privi di germi, che sono considerati il gold standard. Gli uccelli nidificanti sono modelli ideali per la produzione di animali privi di germi poiché non è necessario allevare i loro parenti in condizioni sterili. I polli privi di germi sono generati principalmente da linee sperimentali prive di agenti patogeni specifici (SPF), che sono scarsamente rappresentative delle linee di pollo commerciali. Il metodo qui proposto ha permesso la produzione di polli privi di germi dalla linea di polli da carne a crescita rapida Ross PM3, comunemente utilizzata dall'industria avicola. Le uova sono state rapidamente raccolte dopo la deposizione in una fattoria di allevatori di polli da carne. Hanno subito un rigoroso processo di decontaminazione dalla raccolta all'introduzione in un isolatore sterile per la schiusa delle uova. I pulcini sono stati schiusi e tenuti in questi isolatori sterili durante il periodo necessario per controllarne la sterilità. Originariamente sviluppato per una linea sperimentale SPF a livorno bianca, il presente protocollo è stato adattato non solo alla linea di polli da carne Ross PM3 ma anche alle quaglie. Rappresenta pertanto una procedura robusta e facilmente adattabile ad altre specie avicole e ai volatili nidificanti di rilevanza economica, biologica o ecologica.

Sei cicli di generazione di pulcini privi di germi sono stati condotti con uova Ross PM3 provenienti da due diversi allevamenti francesi (Tabella 1). Sono state raccolte un totale di 853 uova e dopo due fasi di decontaminazione e 19 giorni di incubazione, l'86,40% era vitale. 490 di queste uova vitali hanno subito una terza fase di decontaminazione e sono state introdotte in vari isolatori da cova, per un tasso medio di schiusa del 79,80%. Ciò rappresenta un tasso di schiusa del 68,94% rispetto al numero iniziale di uova raccolte.
Tuttavia, i risultati della schiusa variano sostanzialmente a seconda delle serie effettuate: dal 41,67% all'88,16% dei pulcini vitali rispetto al numero di uova raccolte. Queste variazioni sono state osservate anche tra i diversi boccaporti durante lo stesso esperimento. Poiché non tutti gli isolatori sono stati utilizzati per tutte le corse, è difficile escludere un effetto dipendente dall'isolatore. Tuttavia, questo effetto batch era direttamente correlato all'età delle galline ovaiole (Figura 1), dove le uova provenienti da galline più anziane erano meno vitali.
Le sei corse sono state effettuate utilizzando quattro diversi isolatori di schiusa. Dopo il controllo batteriologico, gli animali di 14 dei 16 isolatori sono stati confermati privi di germi. Ciò corrisponde a un tasso di successo dell'87,5%. I due isolatori rimanenti sono stati contaminati da un singolo batterio ambientale e non patogeno.
Tutti gli animali utilizzati per gli esperimenti scientifici sono rimasti privi di germi fino alla fine degli studi, per almeno tre settimane dopo la schiusa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Figura 1: Effetto dell'età della gallina sul tasso di schiusa La presente cifra evidenzia i tassi di schiusa osservati in base all'età del gregge di galline ovaiole, espressa in settimane di deposizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Uova raccolte</td>
			<td>D19 uova vitali</td>
			<td>D19 uova vitali/uova raccolte</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 1</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 2</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 3</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 4</td>
			<td>totale delle uova trasferite</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 1</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 2</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 3</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 4</td>
			<td>totale dei pulcini nati vitali</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite1</td>
			<td>isolatore vitale di uova tratteggiate/trasferite2</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite3</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite4</td>
			<td c="">uova schiuse/trasferite vitali a livello globale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Risultati tecnici dei diversi esperimenti di schiusa. La presente tabella evidenzia i risultati delle 6 serie di schiusa germ-free effettuate: numero di uova raccolte, vitalità dell'embrione a 19 giorni e pulcini nati vitali nei vari isolatori.

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Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.

Produzione di polli da carne a crescita rapida privi di germi da una linea commerciale per studi sul microbiota

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Views.  INRAE, PFIE, UE-1277. Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.

Video: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da 1 H spettroscopia NMR

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infezione

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. Clinical advancement of novel applications for AAV involves transitioning from small animal models, such as mice, to larger animal models, including dogs, sheep, and nonhuman primates. One of the limitations of administering AAV to larger animals is the requirement for large quantities of high-titer virus. While suspension cell culture is a scalable method for AAV vector production, few research labs have the equipment (e.g., bioreactors) or know how to produce AAV in this manner. Moreover, AAV titers are often significantly lower when produced in suspension HEK 293 cells as compared to adherent HEK293 cells. Described here is a method for producing large quantities of high-titer AAV using cell stacks. A detailed protocol for titering AAV as well as methods for validating vector purity are also described. Finally, representative results of AAV-mediated transgene expression in a sheep model are presented. This optimized protocol for large-scale production of AAV vectors in adherent cells will enable molecular biology laboratories to advance the testing of their novel AAV therapies in larger animal models.

Here we provide a detailed procedure for large-scale production of research-grade AAV vectors using adherent HEK 293 cells grown in cell stacks and affinity chromatography purification. This protocol consistently yields &#62;1 x 1013 vector genomes/mL, providing vector quantities appropriate for large animal studies.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Produzione di polli da carne a crescita rapida privi di germi da una linea commerciale per studi sul microbiota

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