A quantificação de lesões ateroscleróticas em apoE e outros tipos de camundongos hiperlipidêmicos é fundamental para a avaliação de vários fatores genéticos e novas terapias. Nosso protocolo fornece instruções passo a passo para análise da carga aterosclerótica de forma qualitativa e quantitativa em um único mouse. 16 semanas depois de induzir aterosclerose, antes de perfumar o coração, carregar uma seringa de 10 mililitros com 10 mililitros de DPBS e prender uma agulha de calibre 25.
Levante a pele abdominal do rato experimental com pinças e use uma tesoura fina para cortar a pele da base do abdômen até a parte superior do pescoço. Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica e use a pinça para levantar o esterno para acessar o diafragma. Corte o diafragma e corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica.
Em seguida, faça uma pequena incisão no átrio direito do coração e injete lentamente todo o volume de DPBS na punção ventricular esquerda apical. O fígado e o rim vão ficar castanhos claros. Quando toda a solução salina tiver sido perfundida, use uma esponja não enrolada para limpar a cavidade torácica de qualquer sangue e fluido extrainoso.
Depois que a cavidade torácica tiver sido limpa, remova os órgãos não experimentais e corte a clavícula com pinças e tesouras finas. Coloque o mouse sob um microscópio estéreo e use a pinça e a tesoura de mola para dissecar a aorta. Quando a aorta for isolada, cubra o tecido com uma esponja não-torcida encharcada de soro fisiológico e disseque os ramos aórticos, incluindo as artérias braquiocefálicas, carótidas, subclávias, renais, ilíacas comuns e femorais.
Quando todas as artérias ramificadas da aorta tiverem sido isoladas, use pinças e tesouras de mola para dissecar cuidadosamente e remover o adiposo avencionário e o tecido conjuntivo ao redor dos ramos da aorta e da aorta. Um isolamento bem sucedido de aorta e ramos aórticos requer prática e paciência. Para fixar a árvore vascular, primeiro carregue uma seringa de 10 mililitros com 4% de formaldeído em 1X DPBS e conecte uma agulha de calibre 25.
Lembre-se de sempre preparar 4% de formaldeído dentro de um capô de fumaça. Insira a agulha na punção ventricular esquerda apical e injete lentamente todo o volume de fixação. Limpe a cavidade torácica de quaisquer fluidos ínteuos com uma esponja não enrolada como demonstrado e use pinças e micro dissecação de mola para separar o coração da aorta.
Quando os tecidos tiverem sido separados, isole e excise a aorta e seu vaso principal de um milímetro acima da artéria carótida até o final da artéria femoral e coloque o vaso em um recipiente de DPBS. Para a mancha de O Vermelho-Óleo da aorta inteira não aberta, use pinos minutien para fixar o navio em uma placa de cera Petri e enxaguar o navio com DPBS frescos. Despeje 25 mililitros de solução fresca de óleo de 0,45 micrômetros filtrado por poros Vermelho O no prato para uma mancha de 60 minutos à temperatura ambiente.
Submerse o tecido com isopropanol de 60% para uma lavagem de 20 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, enxágue o recipiente três vezes com água fresca destilada por cinco minutos por lavagem e coloque o prato sob o microscópio dissecando. Use pinças e tesouras de mola para limpar suavemente todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta para evitar qualquer falsa coloração de óleo vermelho oposição e transferir o vaso para um slide de microscópio de vidro limpo.
Óleo Vermelho O vai rotular a placa rica em lipídios de vermelho, deixando a não placa contendo áreas pálidas de cor. Em seguida, adquira micrografias digitais de alta resolução com um microscópio leve equipado com uma câmera e salve as imagens de preferência em formato de arquivo de imagem marcado. Para a montagem facial da amostra de tecido aórtico, transfira o vaso para uma placa de cera de Petri e cubra o tecido com DPBS fresco.
Corte as artérias carótidas e subclávias do arco aórtico e das artérias ilíacas na aorta abdominal de um a dois milímetros após as bifurcações. Corte as artérias renais. Em seguida, use uma tesoura de mola de micro dissecação para abrir longitudinalmente a preparação da aorta ao longo da curvatura interna e artérias ilíacas e corte os três ramos do arco aórtico ao longo da curvatura maior até o nível base da curvatura interna.
Em seguida, use pinos minutien para fixar a aorta plana contra o prato sem esticar com o lado lúmen voltado para cima e cobrir o tecido com DPBS frescos. Em comparação com os camundongos eliminatórios apolipoprotein E, as paredes aórticas da célula muscular lisa TGF-beta-R2 nocautear apolipoproteína E camundongos demonstram aterosclerose grave, dificultando a dissecação das lesões. Além disso, os aneurismas são particularmente extensos abaixo da aorta suprarenal, altamente lembrando aneurismas avançados de aorta humana.
Aqui, uma imagem representativa de uma aorta não aberta de uma dieta de alto colesterol de alta gordura alimentada com dieta TGF-beta-R2 nocaute apolipoprotein E mouse manchado com Óleo Vermelho O é mostrado. O camundongo desenvolveu um aneurisma aórtico ascendente e abdominal com formação acelerada de lesão aterosclerótica observada nas artérias braquiocefálica, carótida, subclávia, ilíaca, femoral e renal. Esta coloração de óleo vermelho o de TGF-beta-R2 nocaute apolipoproteína E tecido do rato revela um aumento aneurismal grave e alongamento marcado de toda a aorta em comparação com o grupo de ratos eliminatórios apolipoproteína E.
É importante ser capaz de distinguir placas manchadas oil red o de fundo falso Óleo Vermelho O manchado tecidos adiposos perivasculares. Placas de aterosclerose são fenômenos tridimensionais. Após a quantificação da lesão 2D aórtica en face, recomendamos a análise do conjunto de placas, como raízes aórticas e a artéria braquiocefálica.
Este protocolo também pode ser usado para decidir se um determinado fator genético, intervenção ou tratamento afeta a progressão ou regressão da aterosclerose nesses modelos.
