Neste protocolo, descrevemos um método simples para fabricar um dispositivo baseado em papel chamado XO Pad, que foi projetado para o enriquecimento eficaz no isolamento de vesículas extracelulares. O XO Pad é um dispositivo simples que pode pré-concentrar e isolar vesícula extracelular sem o uso de quaisquer produtos químicos ou máquinas de trabalho, ao mesmo tempo em que mostra taxas de recuperação mais altas do que os métodos convencionais. Comece definindo a região a ser impressa com software de impressora.
O desenho deve ter 12 camadas padronizadas de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de cinco a dois milímetros. Em seguida, imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose. Coloque o papel impresso de cera em um forno de laboratório por 80 segundos a 120 graus Celsius, depois corte o papel impresso de cera com um cortador para fazer dispositivos XO Pad individuais.
Solte um cinco e dois microliters de membrana seletiva perm nas áreas amostrais na maioria das camadas esquerda e direita, respectivamente. Coloque as camadas codificadas com a membrana seletiva perm em uma placa quente a 70 graus Celsius por 30 minutos para evaporar o solvente. Em seguida, sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.
Dobre o dispositivo XO Pad para frente e para trás ao longo das linhas brancas para conectar convergentemente todas as áreas de amostra. Pipeta 15 microliters da amostra de microvesculas e exosóis nas áreas de amostra convergente e esperar alguns segundos para garantir a mochilão completa. Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do XO Pad e fixe-a com clipes pequenos para evitar o desenrolar.
Encha as câmaras com 110 microliters de 0,1X PBS e insira dois eletrodos de prata. Em seguida, use um sistema de medição de fonte de tensão de corrente para aplicar 30 volts nos eletrodos por 20 minutos. Para isolar os microvesculas enriquecidos e exosóis, separe o XO Pad dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar as partículas enriquecidas das outras camadas.
Esmurrem as áreas amostrais nas camadas oito e nove onde os microvesculas e exosóis são enriquecidos para análise a jusante. Um ensaio de migração de lapso de tempo de microvesículos e exosóis rotulados fluorescente foi realizado a fim de otimizar o tempo de operação para a recuperação máxima das partículas enriquecidas. As intensidades de fluorescência em todas as áreas amostrais foram quantificadas com o software ImageJ.
Antes do processo de enriquecimento, microvesículos e exosóis foram dispersados em todas as áreas amostrais com diminuição gradual da intensidade. Após 10 minutos de processamento, as partículas migraram eletro-cineticamente e um plugue de pré-concentração instantâneo apareceu na camada sete. Quando o tempo chegou a 20 minutos, microvesículos e exosóis estavam fortemente focados nas camadas oito e nove e enriqueceram cinco vezes com base nas intensidades de fluorescência.
A integridade dos microvesículos enriquecidos e exosóis na camada oito foi investigada com SEM. Significativamente mais partículas não danificadas foram observadas após o processo de enriquecimento. Também foi analisada a distribuição de tamanho dos microvesículos enriquecidos e exosóis.
Posteriormente, analisou-se a concentração real dos microvesículos enriquecidos e exosóis nas áreas amostrais nas camadas seis, oito e 10. Na camada oito, os microvesculas e exosóis foram pré-concentrados por um fator de 5,58, mas não foi observada pré-concentração perceptível nas outras camadas. Para garantir a reprodutibilidade deste procedimento, seguiu com precisão o protocolo de tempo e temperatura de incubação do forno durante a verificação do dispositivo e o tempo de funcionamento do dispositivo, pois essas são as condições otimizadas.
O XO Pad também pode ser usado para separar e isolar vesícula extracelular de amostras ricas em proteínas, como soro ou plasma, usando tampão de carbonato. Este protocolo pode fornecer uma ferramenta de preparação eficiente e simples, com suas capacidades de pré-concentração e isolamento necessárias para pesquisas clínicas, como diagnóstico, entrega de medicamentos, imunoterapia e outras terapêuticas.
