Name: imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos at JoVE.com

Os autores reconhecem com gratidão o trabalho de Liuliu Zheng e Zenghui Xue, que ajudaram a pioneira nesta técnica no laboratório Sokac, bem como Hasan Seede, que ajudou na análise. O trabalho deste estudo é financiado por uma bolsa do NIH (R01 GM115111).

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	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. 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Nenhum conflito de interesses declarado.

A importância deste método é que utiliza o protocolo bem estabelecido de microinjeção em embriões Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para viabilizar novas pesquisas sobre o ASR e a montagem da haste actin. Uma grande vantagem de injetar G-actinRed em embriões vivos é que o ASR pode ser estudado sob uma variedade de contextos. Para estudos futuros, esses contextos podem incluir injetar embriões de outros genótipos como parte de uma tela mutante ou expor embriões injetados a diferentes condições de estresse, como estresse oxidativo4,32. Embora não descrito em detalhes aqui, esta técnica de injeção também pode ser modificada para injetar ácidos nucleicos, outras proteínas, drogas e corantes indicadores (por exemplo, ver21,22,23,24,32) para estudar o ASR. Assim, este método apresenta uma série de abordagens para identificar a gama de tensões que induzem as RS, caracterizando ainda mais as respostas celulares durante a ASR (por exemplo, mudanças na atividade mitocondrial) e a descoberta de novas moléculas e mecanismos subjacentes à montagem da haste de actina intranuclear.
Algumas etapas críticas do protocolo incluem: Na etapa 3.8, os embriões devem ser devidamente dessecados para garantir a injeção bem sucedida e a melhor saúde do embrião. O tempo de dessecação dependerá da temperatura ambiente e da umidade do laboratório, por isso recomenda-se praticar a montagem, dessecação e injeções com um tampão de pH neutro primeiro para estabelecer este parâmetro para o manuseio dos embriões. Na etapa 4.5, as configurações de microavermelh e injeção devem ser ajustadas para permitir a injeção de G-actinRed suficiente em embriões. Se muito pouco G-actinRed for injetado no embrião, as hastes actina podem não ser facilmente visualizadas, uma vez que a formação de hastes de actin depende da concentração de ato livre em1. Além disso, será difícil obter resultados consistentes de experimentos FRAP se não houver injeção suficiente de G-actinRed, uma vez que a intensidade da fluorescência não será alta o suficiente para superar a fluorescência de fundo. Portanto, é importante calibrar o tamanho da bolha cada vez que uma nova agulha é carregada e usada. G-actinRed é viscoso e tende a entupir dentro do microaclese. Às vezes, isso pode levar à injeção de quantidades variáveis de G-actin nos embriões. Se o microatado estiver entupido e limpar o microaícedo com alta pressão falhar, pode ser necessário tentar quebrar ainda mais a ponta do microacele ou até mesmo carregar um novo microaído e injetar um conjunto fresco de embriões. Finalmente, na etapa 4.11, os embriões devem ser incubados a temperatura elevada e por tempo suficiente para que o ASR seja induzido e as hastes se formem1. As temperaturas de todas as incubadoras devem ser constantemente monitoradas, o tempo para transferir embriões da incubadora para a incubadora deve ser limitado, e um temporizador deve ser usado para todas as incubações. Outros possíveis problemas estão listados na Tabela 2 com dicas de solução de problemas.
Uma das principais limitações deste protocolo é que deve-se tomar um cuidado excepcional para preservar a saúde dos embriões durante injeções, incubações e imagens. O protocolo foi projetado para maximizar a saúde dos embriões e, com uma prática significativa, um pesquisador pode completar todas as etapas do protocolo com o desenvolvimento de embriões progredindo nas taxas esperadas por temperatura31. Uma segunda limitação do protocolo é a necessidade de uma plataforma de microinjeção, que pode ser bastante cara e não é equipamento comum para todos os laboratórios de moscas. No entanto, se um laboratório adjacente estiver equipado para injetar outros embriões (por exemplo, Xenopus, Zebrafish e Caenorhabditis elegans) ou células aderentes, a plataforma de injeção usada é provavelmente adequada para injeções de Dphilrosoa. Nesse caso, apenas a forma da agulha precisa ser adaptada para embriões de Drosophila de acordo com as diretrizes do Pipette Cookbook29. Alternativamente, existem algumas opções de micoinjector menos caras no mercado (por exemplo, microinjetores analógicos), o que pode reduzir significativamente o custo de montagem de uma plataforma de injeção.

Este protocolo descreve como injetar G-actinRed para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)1. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal2,miopatias musculares3,e Alzheimer e Doença de Huntington4,5,6,7,8. Este ASR é induzido por numerosos estresses celulares, incluindo choque térmico9,10,11, estresse oxidativo4,6, síntese ATP reduzida12, e huntingtin anormal ou β-amilóide oligomerização4,5,6,7,9,13,14,15,16. Uma marca registrada do ASR é a montagem de hastes de actina aberrantes no citoplasma ou núcleo das células afetadas, que é impulsionada pela hiperativação induzida pelo estresse de uma proteína interativa de actina, Cofilin1,5,6,10. Infelizmente, permanecem as principais lacunas de conhecimento em relação ao ASR. Por exemplo, a função das hastes de actin não é conhecida. Não entendemos por que as hastes se formam no citoplasma de alguns tipos de células, mas o núcleo de outros. Também não está claro se o ASR é protetor ou mal adaptável para células ou embriões submetidos a estresse. Finalmente, ainda não sabemos os mecanismos detalhados subjacentes à hiperativação de Cofilin ou ao conjunto de hastes actin. Assim, este protocolo fornece um ensaio rápido e versátil para sondar o ASR visualizando a formação e dinâmica da haste actin no sistema experimental altamente tratável do embrião de mosca de fruta viva.
O protocolo para microinjetar G-actinRed em embriões Drosophila vivos foi inicialmente desenvolvido para estudar a dinâmica das estruturas normais de actina citoplasmática17 durante eventos de construção de tecidos. Nesses estudos, descobrimos que a injeçãovermelha G-actin não afetou negativamente os processos de desenvolvimento precoce no embrião, incluindo citocina ou gastraculação17,18. Em seguida, modificamos o protocolo, adaptando o manuseio de embriões e a injeçãovermelha G-actin para permitir a imagem de hastes de actina em embriões estressados pelo calor submetidos ao ASR1. Outros métodos além da injeção de G-actinRed podem ser usados para visualizar actina em embriões. Esses métodos dependem da expressão de proteínas fluorescentes (FPs) marcadas para atuar ou para domínios de proteínas de ligação de actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (revisada em19). No entanto, o uso dessas sondas FP requer cautela, pois podem estabilizar ou interromper algumas estruturas de actina, não rotular igualmente todas as estruturas actin20, e no caso de actin-GFP, são altamente superexpressas – problemáticas para a análise da montagem de haste que não só é dependente do estresse, mas também atua na concentração dependente1. Assim, g-actinred é a sonda preferida para estudos de vara em embriões de mosca, e o grande tamanho do embrião permite sua fácil injeção.
O fluxo de trabalho deste protocolo é semelhante a outras técnicas de microinjeção bem estabelecidas que têm sido utilizadas para injetar proteínas, ácidos nucleicos, drogas e indicadores fluorescentes nos embriões de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. No entanto, após a microinjeção do G-actinRed aqui, os embriões são expostos a um leve estresse térmico para induzir o conjunto de hastes de actina ASR e intranuclear. Para laboratórios com acesso a moscas e uma plataforma de injeção, este método deve ser facilmente implementável e adaptável para linhas específicas de estudo em relação ao ASR, incluindo sua indução por diferentes estresses ou modulação em diferentes origens genéticas.

<table><tbody><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Apple juice, Mott&#039;s, 64 fl oz</td><td>Mott&#039;s</td><td>014800000344</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>For collecting dechorionated embryos</td></tr><tr><td>Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>For imaging intranuclear actin rods</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dissecting needle, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Embryo collection cage</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>For housing adult flies and collecting embryos</td></tr><tr><td>Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>For arranging embryos on agar wedge</td></tr><tr><td>Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>For microneedles</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>For hydration of embryos</td></tr><tr><td>Heated stage incubator</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>For confocal imaging</td></tr><tr><td>Lab Tissue Wipers, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Lab tissue wipers</td></tr><tr><td>Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>Injection microscope</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>For loading microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>For performing microinjections</td></tr><tr><td>Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>For mounting embryos</td></tr><tr><td>Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>For mounting embryos for injection</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Component of embryo glue</td></tr><tr><td>Objective, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Discontinued</td><td>10x objective for injection microscope</td></tr><tr><td>Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x water objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x mixed immersion objective for confocal</td></tr><tr><td>Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x oil objective for confocal</td></tr><tr><td>Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>For blotting cell strainer</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>For covering embryos with oil</td></tr><tr><td>Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>For humid incubation chamber</td></tr><tr><td>Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>For apple juice plates</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>For loading the microneedle</td></tr><tr><td>Pipette tip, xTIP4 250 &amp;mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>For adding embryo glue to coverslip</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &amp;mu;g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>For making embryo glue</td></tr><tr><td>Screw top jar, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>For desiccating embryos</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>602104PG</td><td>For calibrating volume of G-actin injection</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Component of apple juice plates</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Component of G buffer</td></tr><tr><td>Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Component of yeast paste</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

O objetivo deste protocolo é visualizar hastes de actina intranucleares que se reúnem em embriões de melanogaster Drosophila vivos após estresse térmico. As hastes actina são uma marca registrada de uma Resposta ao Estresse Actin (ASR) conservada e indutível que acompanha patologias humanas, incluindo doenças neurodegenerativas. Anteriormente, mostramos que o ASR contribui para falhas de morfogênese e viabilidade reduzida do desenvolvimento de embriões. Este protocolo permite o estudo contínuo dos mecanismos subjacentes à montagem da haste actin e do ASR em um sistema modelo altamente favorável à imagem, genética e bioquímica. Os embriões são coletados e montados em uma tampa para prepará-los para injeção. A actina globular conjugada por rhodamina(G-actin Red) é diluída e carregada em uma microacela. Uma única injeção é feita no centro de cada embrião. Após a injeção, os embriões são incubados a temperatura elevada e as hastes de actina intranuclear são então visualizadas por microscopia confocal. A recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) pode ser realizada nas hastes de actin; e outras estruturas ricas em actina no citoplasma também podem ser imagens. Descobrimos que o G-actinRed polimeriza como g-actina endógeno e não interfere, por si só, no desenvolvimento normal de embriões. Uma limitação deste protocolo é que deve-se tomar cuidado durante a injeção para evitar ferimentos graves no embrião. No entanto, com a prática, injetar G-actinRed em embriões de Drosophila é uma maneira rápida e confiável de visualizar hastes de actina e pode ser facilmente usada com moscas de qualquer genótipo ou com a introdução de outros estresses celulares, incluindo hipóxia e estresse oxidativo.

Um fluxo de trabalho esquemático de manuseio de embriões é retratado na Figura 1, e um cronograma para um experimento típico é apresentado na Tabela 1. Uma estimativa para um bom resultado experimental é que para cada 10 embriões injetados, pelo menos metade dos embriões vistos estará no estágio correto de desenvolvimento, não danificado, e exibirá um ASR robusto com estresse térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado pela montagem de hastes de actina intranuclear, como mostrado na imagem de visão de superfície representativa de um embrião na Figura 2A (painel direito). As hastes actina aparecerão em várias orientações (paralelas ou perpendiculares ao plano de imagem) dentro dos núcleos e podem ser imagens através de vários planos focais. Em comparação, os embriões de controle incubados a 18 °C não exibirão hastes de actin(Figura 2A, painel esquerdo). Os núcleos por cento contendo hastes podem ser quantificados, como demonstrado na Figura 2B. Além disso, experimentos FRAP podem ser realizados em hastes(Figura 2C). Um método de quantificação sugerido para dados FRAP é referenciado em1 e um exemplo de um gráfico de recuperação de fluorescência para uma região branqueada versus não branqueada de uma haste de actin é mostrado na Figura 2D.
Se um embrião for severamente danificado pela injeção ou ficar muito seco durante o experimento, a assincronia mitótica pode ser observada e a celularização será interrompida. Às vezes, as hastes podem não ser visíveis por causa da falha em ter a actina suficiente injetada no embrião. Se isso acontecer, certifique-se de que a quantidade de G-actinRed injetado é de 500 pL (medido com um micrômetro na etapa 4.5) e confirme que essa quantidade permanece consistente entre os embriões fazendo uma injeção de teste no óleo circundante para verificar o tamanho da bolhavermelha G-actin entre cada microinjeção de embriões. Além disso, para garantir a visualização da haste, trabalhe rapidamente para adicionar o deslizamento de tampa e mover os embriões para o estágio de microscópio aquecido uma vez que eles são retirados da câmara úmida na etapa 5.4, pois o conjunto da haste é reversível1 e as hastes podem desmontar se os embriões forem mantidos a uma temperatura inferior a 32°C por mais de 30 minutos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig1.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do manuseio de embriões durante o experimento. (1) Moscas adultas em copos de coleta de embriões colocam embriões em pratos de ágar de suco de maçã. (2) Os embriões são descorrioados com 1:1 água alvejada: destilada, derramada em uma cesta de coleta e completamente lavada com água destilada para remover alvejante e detritos. (3) Os embriões são transferidos com um pincel para uma cunha retangular de suco de maçã em um escorregador e dispostos em seus lados, cabeça-a-cauda, com região dorsal voltada para a borda do ágar. (4) Uma região de 5 x 50 mm de um deslizamento de vidro (laranja) é revestida com "cola de embrião" e pressionada suavemente para baixo na fileira de embriões dispostos no ágar para aderir ao deslizamento de cobertura. (5) O deslizamento com embriões é invertido para que os embriões enfrentem. Os embriões são dessecados em um frasco de rosca. (6) Imediatamente após a proficação, o deslizamento é colado a um slide, embriões voltados para cima e embriões são cobertos com óleo halocarboneto 27. (7) Um microagulha previamente carregado com vermelho G-actin preparado é usado para fazer uma única injeção no centro da região ventral de cada embrião, com agulha posicionada paralelamente à mancha de cobertura. (8) Após a injeção, os embriões são incubados dentro de uma placa de Petri umidificada com limpadores de tecido de laboratório úmidos na temperatura de controle (18 °C) ou com estresse térmico (32 °C). (9) Após a incubação, a mancha de cobertura com os embriões sobre ele é removida do slide. (10) Duas peças de fita dupla face são colocadas em camadas uma em cima da outra, cortadas ao meio do comprimento e colocadas em ambos os lados do óleo ao redor dos embriões na primeira mancha de cobertura. Uma segunda mancha de cobertura (azul) é colocada em cima da primeira para criar uma nova superfície de imagem, compensada de modo que deixe uma lacuna para que mais óleo seja adicionado para cobrir os embriões conforme necessário. (11) Se a imagem em um microscópio confocal invertido, o sanduíche de deslizamento de cobertura é invertido de modo que o segundo deslizamento de cobertura enfrenta o objetivo. A imagem é feita em uma câmara incubada, e as hastes de actina são visualizadas sobre vários planos focais dos núcleos de cada embrião. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos de hastes de actina em embriões estressados pelo calor. (A) As hastes de actina não são vistas em um embrião que foi incubado à temperatura de controle de 18 °C (painel esquerdo), mas são vistas nos núcleos de um embrião que foi estressado pelo calor a 32 °C (painel direito). (B) Quantificação do percentual de núcleos com hastes actinas de um experimento representativo. Cada ponto representa um embrião onde varas e núcleos foram contados em toda a região imagem (n = 22 embriões a 18 °C; n = 23 embriões a 32 °C; barras de erro mostram desvio padrão). O teste t de um aluno, com variância desigual assumida, foi usado para calcular o valor p. (C) Uma série temporal representativa mostra FRAP em uma haste actin. A porção da haste que foi branqueada é indicada por uma ponta de flecha branca. O pré-alvejante é 2 s antes do passo alvejante. Tempo = 0 s é o passo do alvejante, e a recuperação da fluorescência foi rastreada até os 60 ºC pós-alvejante. (D) Uma trama mostra a dinâmica de recuperação da fluorescência actin em uma região branqueada de uma haste, em comparação com uma região não branqueada na mesma haste. As hastes são notavelmente estáveis e a actin dentro delas não faz volume de negócios. Assim, nenhuma recuperação é vista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61297/61297fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Fluxo de trabalho experimental com cronograma sugerido. Este cronograma resume o tempo esperado para completar cada etapa do protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Ordem</td>
			<td>Passo</td>
			<td>Tempo necessário para cada etapa</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>5 dias de antecedência</td>
			<td>Faça gaiolas de coleta de embriões. Despeje pratos de ágar de suco de maçã.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.2-1.3</td>
			<td>2 dias de antecedência</td>
			<td>Montar gaiolas de coleta com moscas adultas masculinas e femininas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.6 Nota</td>
			<td>1 dia de antecedência</td>
			<td>Puxe tubos capilares para fazer microaídas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>2.1-2.6</td>
			<td>1 h</td>
			<td>Prepare G-actin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>3.1</td>
			<td>30 min.</td>
			<td>Permita que as moscas coloquem ovos.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3.2-3.10</td>
			<td>15-30 min</td>
			<td>Coletar, montar, dessiccate embriões. Cubra embriões com óleo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4.1</td>
			<td>30 min de antecedência</td>
			<td>Prepare câmaras de incubação úmidas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>4.2-4.4</td>
			<td>1 min</td>
			<td>Carregar microaída.</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>4.5-4.10</td>
			<td>10-20 min</td>
			<td>Calibrar o tamanho da bolha G-actin e injetar embriões.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>4.11</td>
			<td>30 min-1+ h</td>
			<td>Incubar/aquecer embriões de estresse.</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>5.1-5.3</td>
			<td>1h de antecedência</td>
			<td>Ligue o microscópio e o estágio de incubação.</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>5.4-5.10</td>
			<td>5 min.</td>
			<td>Embriões de sanduíche entre tampas para imagens.</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>5.11-6.6</td>
			<td>15 min-1+ h</td>
			<td>Imagem de actina intranuclear em embriões.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Sugestões de solução de problemas. Esta tabela fornece sugestões para a solução de problemas para ajudar na conclusão bem sucedida do protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Problema potencial</td>
			<td>Sugestões</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moscas não colocam embriões suficientes.</td>
			<td>Configure o copo com pelo menos 5 dias de antecedência (consulte as etapas 1.1-1.3). Troque as placas 3x por dia que antecedem o experimento para incentivar a colocação de ovos. Deixe as moscas colocarem embriões por 1 h em vez de 30 min. Montar copos com moscas jovens adultas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nenhum G-actin é expulso do microaícedo.</td>
			<td>Aumente as configurações de pressão e tempo no microinjetor. Quebre ainda mais a ponta da microacele (consulte a etapa 4.5 Nota). Já que os grandes tamancos podem não limpar, carregue uma nova agulha.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil calibrar um tamanho de bolha pequeno o suficiente.</td>
			<td>Ajuste as configurações de pressão e tempo (consulte a etapa 4.5). Uma vez que a abertura da ponta da microagulha pode ser muito grande, carregue uma agulha nova.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Os embriões liberam da cola na tampa durante a injeção.</td>
			<td>Ajuste a consistência de "cola de embrião" para deslizamentos de cobertura futuras adicionando mais fita dupla face à solução heptana (consulte a etapa 3.5 Nota).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Embriões secam durante a incubação da temperatura.</td>
			<td>Certifique-se de que o slide está nivelado na câmara de incubação (consulte a etapa 4.11) e que o óleo não está tocando em nada que possa afastá-lo. Adicione gotas extras de óleo aos embriões. Diminua o tempo de profetação pré-injeção (consulte a etapa 3.8).</td>
		</tr>
<tr>
<td>O óleo não cobre completamente os embriões entre a primeira e a segunda tampas.</td>
			<td>Adicione óleo extra através de ação capilar à pequena lacuna entre as tampas (consulte a etapa 5.8 Nota).</td>
		</tr>
<tr>
<td>As hastes de actina intranuclear não são visíveis em embriões estressados pelo calor.</td>
			<td>Injete um volume maior de G-actin (consulte a etapa 4.5). Confirme que a temperatura tanto da incubação pós-injeção (refere-se à etapa 4.11) quanto da câmara de imagem são de 32 °C (consulte a etapa 5.3).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grandes bolhas de G-actin são visíveis ao redor do local de injeção de embriões.</td>
			<td>Injete um volume menor de G-actin (consulte a etapa 4.5). Aumente o tempo de dessecação do embrião para promover uma melhor retenção da actina injetada dentro do embrião (consulte a etapa 3.8).</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

3.4K visualizações.  Baylor College of Medicine. O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.

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Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Biologia do Desenvolvimento

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Neurociência

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biologia

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Visualização de redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor em destaque: Compreendendo a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

Resumo

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Imagem Vertical de

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Imagens de cálcio na

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos