Estamos interessados em descobrir novos mecanismos celulares e moleculares que controlam a estaminalidade das células. Nosso principal objetivo é decifrar como as células-tronco evitam a diferenciação nos nichos. Como estamos trabalhando em condições experimentais, é essencial preservar a integridade do tecido para garantir que os GSCs recebam um comportamento fisiológico.
Nosso protocolo mantém um nicho de GSC saudável e funcional, permitindo o monitoramento da divisão de GSCs como seriam in vivo. O uso de imagens de vida prolongada nos permite estudar todo o ciclo celular das GSCs e a dinâmica dos espectrossomos. Especificamente, caracterizamos com sucesso as mudanças espectrosômicas ao longo do ciclo celular, uma tarefa que antes era difícil de realizar com imagens fixas ou períodos de imagem mais curtos.
Saber realizar principalmente experimentos sem afetar sua dinâmica nos permite explorar como as células de nicho se comunicam. Queremos estudar mecanismos regulatórios da expressão gênica e do metabolismo celular mediados pela interação direta entre mRNAs, enzimas metabólicas na biologia das células-tronco. Para começar, prepare alíquotas de 100 microlitros da mistura de antibióticos estreptomicina penicilina a uma concentração de 10.000 unidades por mililitro.
Prepare todos os outros reagentes necessários para o procedimento e armazene-os adequadamente. Colete moscas de um a dois dias expressando o par um expresso de forma ubíqua e constitutiva fundido ao GFP em um novo tubo. Cultive as moscas por dois dias a 25 graus Celsius em uma incubadora antes da dissecação.
Coloque uma gota de três microlitros do adesivo específico Cell-Tak no centro da lamínula de cobertura de uma placa revestida de poli-D-licina de 35 milímetros. Adicione imediatamente um volume igual de bicarbonato de sódio 0,1 molar com um pH de oito à gota adesiva de três microlitros. Misture a solução com uma pipeta.
Para evaporação completa, incube a placa com sua tampa em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, guarde o prato a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de descongelar a placa no dia seguinte, lave-a três vezes com seis microlitros de água pura em autoclave com cuidado, sem tocar e perturbar a camada adesiva.
Deixe a água evaporar completamente em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Para começar, cultive as moscas e prepare a placa de fundo de vidro com o revestimento. Em seguida, limpe um prato de dissecação de três poços, pinças e agulhas de dissecção com etanol a 70%.
Adicione aproximadamente 200 microlitros de solução de campainha a cada um dos três poços da placa de dissecação. Usando uma pinça, agarre a fêmea Drosophila na interseção do tórax e do abdômen. Rasgue suavemente a cutícula na parte posterior do abdômen e puxe-a para trás para expor os ovários.
Depois de dissecar os ovários, transfira-os para o próximo poço para reduzir a contaminação com restos de tecido ou detritos da dissecção. Sob um microscópio estéreo com iluminação LED, use um par de pinças finas para ancorar todo o ovário e o segundo par para pegar uma câmara de óvulos em estágio avançado. Alongue suavemente até que a bainha muscular se rompa e fique para trás.
Usando uma pinça, transfira os 15 a 20 ovariais livres da bainha muscular, um por um, para o terceiro poço contendo 200 microlitros de meio de ringer. Umedeça previamente uma ponta de 200 microlitros com 0,1% Tween 20 para evitar que os ovariais grudem na parede da ponta. Transfira seis microlitros de solução de ringer contendo os ovariais sem bainha muscular usando a ponta pré-umedecida para a placa adesiva preparada à temperatura ambiente.
Usando uma agulha de dissecção ou fórceps, pressione cuidadosamente os ovariais na parte inferior da gota de ringer para garantir o contato com a superfície adesiva. Em seguida, adicione três mililitros de meio Schneider, suplementado com 15% de FBS e 0,6% de mistura de antibióticos de penicilina estreptomicina à placa MatTek. Transportar a placa contendo os ovariais sem bainha muscular numa superfície plana para a estação de microscópio.
Coloque a placa na objetiva 63x de um microscópio de disco giratório ou de um microscópio confocal. Focalize a amostra e selecione o plano Z médio para cada germânio. Para configurar os parâmetros experimentais, defina o tipo de captura como lapso de tempo 3D.
Ajuste a potência do laser para 70% do máximo. Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros. A faixa da pilha Z para 30 micrômetros e a distância entre as pilhas Z para 1,2 micrômetros.
Defina o intervalo entre os pontos de tempo para cada 10 minutos e a duração para 17 horas. Se disponível, use a opção de várias posições para redefinir o XY das amostras. Selecione o plano Z no meio de cada germário para que as pilhas Z sejam centralizadas nesta posição e inicie a aquisição.
Analise as imagens no tempo e ao longo do eixo Z para visualizar mudanças na morfologia do espectrossomo usando o software Imaris ou Image J. Para criar os filmes, selecione manualmente o melhor plano Z em cada ponto de tempo. O forte sinal GFP par um da zona espectral redonda G2 foi significativamente reduzido durante as fases G2 MG1.
Durante o início da prófase, a GFP deixou o espectrossomo e preencheu o citoplasma, indicando a entrada de células-tronco germinativas na mitose. Após a mitose e a reforma do envelope nuclear, o sinal GFP par um se recuperou gradualmente no ciclo redondo do G1 Spectro. A edição de Denovo do par GFP para o espectrossomo redondo G1 levou à formação de morfologias de espectrossomo de plugue, barra e fusão.
