Este método aborda os desafios na observação da fluorescência profunda em Brotos de Arroz, como uma penetração limitada de tecido da solução de compensação e a resolução real sob microscópio confocal. A principal vantagem dessa técnica é a observação estrutura de tecidos muito grandes de uma perspectiva macro, mesmo com tecidos duros e grossos, como brotos adultos. Este método se aplica à imagem profunda de tecidos duros e grossos em espécies de plantas largas.
Pode ajudar a acelerar a descoberta de novos fenômenos na pesquisa biológica vegetal. Para começar, corte as raízes cuidadosamente sem danificar as plantas e lave-as com água para remover a sujeira. Agora, use pinças para descascar as velhas folhas externas.
Para evitar esmagar as células, use uma navalha de um único gume com um movimento deslizante para cortar o tecido da filmagem, meristem apical ou jovem pânico para a base. Se a posição do meristem apical de tiro ou jovem pânico não for visível, corte-o por mais tempo. A sessão de arroz tem uma seção oval.
Use uma navalha de dois gumes para raspar um lado do oval finamente, na direção de seu eixo longo. Confirme a posição do meristem apical ou jovem pânico pelo aparecimento de uma cor branca na amostra e corte o excesso de tecido. Coloque a amostra em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de solução fixa.
Corte um filme de 2,5 centímetros quadrados de parafina e modele-o em uma bola. Agora, coloque essas bolas em cima das amostras para evitar que elas flutuam para fora da solução fixa. Coloque o tubo contendo a amostra em um desiccador.
Feche a tampa do dessecodor e inicie a bomba de vácuo para despressurizar lentamente o interior do dessecador até que menos 0,095 a pressão de megapascals seja atingida. Depois de fechar o desiccador a menos 0,095 megapascals, desligue a bomba de vácuo e deixe-a ficar por 30 minutos em temperatura ambiente. Abra o desiccador ligeiramente e lentamente devolva-o à pressão atmosférica.
Se a amostra estiver corretamente fixada, ela afunda na solução fixativa. E se não afundar, reduza a pressão novamente. Remova o filme de parafina.
Feche a tampa e mantenha os tubos durante a noite a quatro graus Celsius. Usando lenços sem fiapos, remova a solução fixativa em excesso da amostra e fixe a amostra em uma bandeja vibratória de micro-fatiador com cola instantânea. Coloque a amostra em uma bandeja com o lado plano para baixo que foi raspado durante a amostragem e coloque as condições de corte de acordo com a amostra fixa.
Ajuste a posição da amostra com o botão de ré ou para a frente e o botão para cima ou para baixo e encha a bandeja com água desionizada até que todas as amostras estejam imersas. Depois de encher a bandeja, pressione o botão de partida e coloque as amostras aparadas em um slide de vidro com uma gota de PBS. Verifique a amostra contendo o local alvo sob um microscópio estéreo e transfira a amostra aparada para uma placa multi-poço com um mililitro de PBS.
Remova o PBS da placa multi-poço. Adicione pbs fresco e deixe-o ficar por um minuto. Remova o PBS e adicione o CS. Coloque a placa multi-poço contendo a amostra em um desiccador e feche a tampa.
Em seguida, inicie a bomba de vácuo para despressurizar o interior do dessecador até menos 0,09 megapascals, lentamente. Depois de fechar o desiccador a menos 0,09 megapascals, desligue a bomba de vácuo e deixe-a parada por uma hora em temperatura ambiente. Abra o desiccador ligeiramente e lentamente devolva-o à pressão atmosférica.
Despeje água deionizada na abertura entre os poços para evitar a evaporação do CS e armazene as placas multi-poços à temperatura ambiente no escuro para limpeza. Quando o CS ficar verde, substitua-o por uma solução nova. As amostras não aparadas permaneceram verdes e não se tornaram transparentes após três meses de tratamento com as amostras CS.In que foram descascadas todas as folhas que os nós inter ficaram brancos após uma semana, embora os nódulos permanecessem verdes.
A amostra não se tornou transparente após quatro semanas. As amostras de aparamento da mão ficaram brancas após uma semana de tratamento de CS, mas não se tornaram transparentes após quatro semanas. As amostras aparadas a 130 micrômetros de espessura tornaram-se translúcidas após uma semana de tratamento de CS.
A amostra foi quase transparente após duas semanas. No nó, a profundidade observável após uma semana do tratamento de CS foi de menos 60 micrômetros e menos 90 micrômetros após duas semanas. Sinais fluorescentes foram observados a uma profundidade de menos 80 micrômetros em três semanas e a uma profundidade de menos 100 micrômetros em quatro semanas.
No internade, foram observados sinais fluorescentes a uma profundidade de menos 60 micrômetros sem o tratamento de CS. A profundidade observável foi de menos 90 micrômetros após uma semana a três semanas de tratamento CS e menos 100 micrômetros após quatro semanas. Nas folhas, sinais fluorescentes foram observados a uma profundidade de menos 90 micrômetros sem tratamento de SC, mas o brilho era mais fraco do que outros tecidos.
Após uma semana, os sinais foram mais brilhantes e observados a uma profundidade de menos 120 micrômetros. A expressão do fator de transcrição OS MASU 15 mOrange foi observada no jovem Panicle, folha, nó, internode e fleurette. A chave é encontrar as melhores condições para as plantas ou tecidos, por exemplo, pressão de período e vácuo, ou posição, e tratamento de CS, tempo, espessura, velocidade e solução de coloração adequada.
A combinação de tecnologia de cronometragem e cura permite a observação temporal espacial do padrão de expressão genética e da comunicação intercelular em múltiplos tecidos de uma única seção.
