A decomposição do tecido adiposo em subtipos tem sido desafiadora porque a natureza frágil do adipócito. Este protocolo foi desenvolvido para superar isso pelo isolamento efetivo de núcleos únicos. Este fluxo de trabalho fornece núcleos únicos altamente purificados com agregados nucleares minimizados e detritos celulares.
Isso é vantajoso para o perfil de transcrição de células únicas de milhares de células. Este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização do nível de tecido de adipócito em suas células residentes adiposas. E, em particular, para o desenvolvimento de fenotipagem, nocaute adiposo e camundongos transgênicos.
A demonstração visual deste protocolo é fundamental para que as pessoas que não têm muita experiência em lidar com adipócitos possam replicar e discernimento sobre a heterogeneidade adiposa. Depois de coletar tecido adiposo de camundongos, bata-o seco com uma toalha de papel, e coloque-o em um prato limpo. Adicione cloreto de cálcio ao tampão de digestão a uma concentração final de 10 mM.
Em seguida, adicione um pequeno volume ao tecido e pique-o completamente. Adicione cerca de metade da quantidade de tampão de digestão preparado ao tecido picado. E use uma pipeta sorológica para transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 50 mL.
Lave o prato com o tampão restante e adicione-o ao tubo de 50 mL. Pipeta a amostra para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, incuba-o por 12 a 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto treme a 200 a 210 rpm.
Após a incubação, adicione 0,5% de BSA à amostra em uma proporção de volume de 1 a 1 e misture bem por pipetação. Centrifugar a amostra a 300 xg por cinco minutos à temperatura ambiente para girar a fração estromovascular deixando a fração de adipócito em cima. Filtre a fração superior através de um filtro de célula de 400 m em um tubo de 50 mL.
Em seguida, vire o filtro de cabeça para baixo sobre o tubo e transfira os adipócitos para um novo tubo usando 0,5% BSA para lavar o filtro reversa. Leve o volume total da BSA para 10 a 15 mL e pipeta a amostra para cima e para baixo com pipeta sorológica. Em seguida, centrifuá-lo novamente a 300 xg por cinco minutos em temperatura ambiente.
Após a centrifugação, use uma ponta de pipeta larga para transferir cuidadosamente a camada superior da amostra para um filtro de célula de 100 m em cima de um novo tubo pré-refrigerado no gelo. Enxágüe o filtro com uma quantidade suficiente de tampão de preparação de núcleos e, em seguida, descarte-o. A partir deste passo em frente, mantenha uma amostra no gelo e trabalhe rapidamente.
Deixe a amostra no gelo por até dois minutos invertendo intermitentemente o tubo para misturar. Em seguida, centrífuga a 1000 xg e 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de tampão de preparação de núcleos.
Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuagem limpo, cuidando para evitar tocar nas paredes do tubo antigo. Adicione 0,6 unidades por inibidor L RNase e misture-o. Em seguida, centrifugar a amostra por mais 10 minutos.
Remova o supernatante e resuspenja uma pelota e 1 mL de tampão de lavagem de núcleos. Filtre duas vezes a amostra em um tubo limpo usando filtros empilháveis de 30 m. Em seguida, lave os filtros com cerca de 300 L de tampão de lavagem de núcleos.
Para confirmar o isolamento bem-sucedido de núcleos saudáveis, colori uma pequena alíquota da amostra com tripano e use um contador celular automatizado para avaliar o tamanho médio dos mortos e por cento das células mortas. Colora em uma pequena alíquota da amostra com DAPI e examine-a sob um microscópio com um objetivo de 20X ou superior. Os núcleos devem ser redondos e ter uma membrana nuclear intacta.
Setas brancas indicam núcleos sem uma membrana intacta. Depois de limpar os núcleos com FACS, concentre esta amostra por centrifugação a 500 xg por cinco minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, reconstitua-o em um volume apropriado de tampão de lavagem de núcleos.
Para alcançar um 50 a 1500 núcleos por concentração de L e proceder com núcleos unicelulares RNA seq. Para remover detritos celulares e dobras, núcleos de adipócitos são classificados para tamanho e granularidade para excluir agregados nucleares e multiplets. E finalmente para eventos positivos da DAPI.
Esta estratégia de classificação resulta em núcleos únicos altamente purificados com agregados mínimos e detritos. Quando inspecionados por microscopia, os núcleos classificados devem ser redondos e ter uma membrana intacta. A purificação bem sucedida dos núcleos também pode ser realizada com qRT-PCR em tempo real usando primers para ucp1 mRNA nascente, um gene marcador para adipócitos marrons.
A plataforma de cromo determinou um transcriptome de 7500 núcleos de tecido adiposo marrom murine interscapular. Sete tipos diferentes de células foram revelados com redução de dimensionalidade t-SNE e agrupamento k-meio. Todos os clusters expressaram Fabp4, um gene de adipócito pan e um subconjunto expresso um alto nível de Ucp1 mRNA.
Os núcleos se isolaram e confirmaram que este protocolo pode ser submetido a praticamente qualquer plataforma de expressão genética de nível de célula única, incluindo o Cromo de 10x Genômica.
