Este trabalho foi apoiado em parte pelo Núcleo de Engenharia e Tecnologia Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) e (1R01HL142290) e a American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes da Universidade de Maryland Baltimore e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos.
1. Preparação das soluções
NOTA: Prepare as soluções com antecedência. Dois tipos de soluções básicas são utilizadas nos experimentos: (1) soluções fisiológicas de soro fisiológico (PSS) para superfusato de banho e (2) soluções de Tyrode para o perfusato de lúmen. O borbulhamento contínuo com CO2 é necessário para manter o pH do PSS. A solução de Tyrode tamponada pelo HEPES é usada no lúmen em vez de PSS para evitar que bolhas entrem nos vasos, uma vez que as bolhas danificariam as células endoteliais7 e ocluiriam o fluxo.
<ol><li>Solução PSS: Veja a fórmula e a composição da solução PSS na Tabela 1. Faça 10 L de Ca2+-free e sem glicose solução de estoque PSS e armazene a temperatura ambiente. 1 h antes de qualquer procedimento, tire 1 L da solução de estoque e bolha com 5% de CO2 (74% N2 e 21% O2) para manter o pH da solução em ~7,4. Adicione 1,8 g de glicose e 1,8 mL CaCl2 (1 M de estoque)8. NOTA: Adicione Ca2+ somente depois de borbulhar quando o pH estiver ~7.4, caso contrário, Ca2+ será precipitado.</li>
	<li>Solução de Tyrode: Veja a fórmula e a composição da solução do Tyrode na Tabela 1. Filtre a solução (0,22 μm) e armazenada a 4 °C para uso futuro9.</li>
	<li>Solução de Tyrode com BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Adicionar BDM como um inibidor reversível de miofilação para evitar a contração dos miócitos10. Pese 600 mg BDM e adicione a 200 mL da solução de Tyrode. Mexa a solução com BDM até que esteja completamente dissolvida. Não é necessária mais filtragem.</li>
	<li>Armazene a solução do Tyrode contendo BDM a 4 °C para uso futuro.</li>
</ol>2. Preparação da câmara
<ol><li>Cubra a câmara de dissecação e a câmara experimental com antecedência com polidimetilasiloxano (PDMS) seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.</li>
	<li>Encha a câmara de dissecação com a solução do Tyrode contendo BDM.</li>
	<li>Ligue o refrigerador 1h antes do procedimento. Coloque a temperatura em 4 °C.</li>
</ol>3. Preparação da cânula
<ol><li>Ligue o puxador de micropipette. Selecione as configurações de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Tome um tubo de vidro borossilicato limpo (o diâmetro externo e interno dos tubos de vidro utilizados foi de 1,2 mm e 0,69 mm, respectivamente).</li>
	<li>Insira um tubo de vidro nos grampos ranhurados de um puxador de pipeta Sutter com um filamento de aquecimento de platina em forma de U.</li>
	<li>Ative o puxador para produzir duas cânulas, cada uma com uma ponta fina longa.</li>
	<li>Corte a ponta de cada cânula usando um belo par de tesouras sob um microscópio dissecando para fazer o diâmetro final da ponta em torno de 100 a 150 μm.</li>
	<li>Coloque o polimento da ponta da cânula cortada para contornar ligeiramente as bordas afiadas.</li>
	<li>Dobre a cânula ao longo do eixo usando um fio de platina (aquecido com controle fino) posicionado na lateral do eixo aproximadamente 2 mm da ponta. O ângulo da curva na cânula deve ser de cerca de 45°.</li>
	<li>Insira a extremidade aberta da cânula no suporte da câmara de miógrafo de pressão e aperte a montagem. Conecte uma seringa de 5 mL preenchida com a solução de Tyrode para o outro lado do encaixe. Conecte a cânula a um micromanipulador montado na câmara (ver Figura 1 e Figura 2).</li>
	<li>Encha a cânula com a solução de Tyrode usando a seringa (5 mL), lavando-a, o tubo e o conector das bolhas de ar.</li>
	<li>Antes do procedimento de canulação, meça a pressão de perfusão dentro da cânula sobre uma determinada faixa de fluxo (50 a 300 μL/min, Figura 3). Faça isso somente quando uma nova cânula é usada. NOTA: A pressão de perfusão dentro da cânula é proporcional ao fluxo e é linear(Figura 3).</li>
</ol>4. Extração do coração do rato
<ol><li>Coloque um rato C57BL/6 (sexo, 8-16 semanas de idade) na caixa de anestesia que está conectada aos tanques de isoflurane e oxigênio.</li>
	<li>Ligue o tanque de oxigênio e inicie o fluxo de isoflurane. Espere ~5 min até que o mouse esteja totalmente anestesiado.</li>
	<li>Após a anestesia ser estabelecida, tire o rato da caixa de anestesia e injete heparina IP (na cavidade peritoneal, 360 unidades, 0,5 mL/rato) para evitar a formação de coágulos sanguíneos na vasculatura. Em seguida, coloque o rato de volta na caixa de anestesia.</li>
	<li>10 minutos após a injeção da heparina, mova o mouse para a cama aquecida em uma posição supina e estabilize suas patas usando fita de rotulagem. Mantenha o rato sob anestesia completa com isoflurano usando um cone de nariz.</li>
	<li>Levante a pele abdominal do camundongo acima do diafragma com fórceps e use uma tesoura cirúrgica para cortar e expor o diafragma.</li>
	<li>Corte o diafragma e o esterno. Abra o peito.</li>
	<li>Dissecar o coração para fora da cavidade torácica, cortando o mais próximo possível da parede torácica dorsal.</li>
	<li>Coloque o coração na solução de Tyrode gelada contendo 30 mM BDM.</li>
	<li>Limpe o coração para remover os tecidos conjuntivos, como o pulmão.</li>
	<li>Transfira o coração para a câmara de dissecação pré-refrigerada cheia de solução de Tyrode contendo BDM de 30 mM.</li>
</ol>5. Preparação e cannulação da artéria septal
<ol><li>Ligue a bomba de servo. Ajuste a bomba de servo para o modo "fluxo". Deixe-o funcionar em alta velocidade até que a tubulação esteja cheia com a solução do Tyrode que será usada para perfundir o lúmen vascular. Certifique-se de que não há bolhas na tubulação. Em seguida, abaixe a velocidade.</li>
	<li>Coloque o coração no PDMS, evitando qualquer dano na área do meio do coração.</li>
	<li>Remova a ária direita e esquerda. Abra o ventrículo direito e remova a parede livre ventricular direita usando um microscópio dissecando.</li>
	<li>Exponha e identifique a artéria septal. Coloque uma linha de nylon (30 μm de diâmetro) sob a artéria septal e amarre um nó solto para uso futuro. NOTA: A artéria septal pode ser facilmente identificada usando um microscópio dissecando. A artéria septal é uma artéria importante no septo originário da artéria coronária direita na maioria dos casos.</li>
	<li>Remova a parede livre ventricular esquerda usando uma tesoura fina.</li>
	<li>Transfira a preparação do músculo papilar para a câmara experimental na qual a cânula foi posicionada. A câmara está cheia com a solução de Tyrode contendo BDM. A parte inferior desta câmara é revestida com uma fina (~2 mm) camada de PDMS.</li>
	<li>Ajuste a posição da cânula (usando o micromanipulador) para permitir a cannulação da artéria septal. Aperte o nó.</li>
	<li>Fixar o músculo papilar usando pequenos pinos no chão da câmara para que o objetivo do microscópio tenha uma visão clara da vasculatura. Preste atenção ao ângulo e à posição da cânula e certifique-se de que a ponta da cânula esteja paralela à parede arterial.</li>
	<li>Teste aculação expulsando gradualmente a solução da seringa através da cânula. Se todos os elementos funcionarem corretamente, o sangue residual no músculo papilar sairá do tecido no início deste processo e apenas a solução de Tyrode será vista mais tarde.</li>
</ol>6. Estabilização da preparação
<ol><li>Ligue a bomba peristáltica que fornecerá a solução de superfusão. Em seguida, sobrefundir constantemente a preparação no banho com PSS pré-gaseado à taxa de 3-4 mL/min.</li>
	<li>Ligue o controlador de temperatura para a solução de superfusão. Ajuste a temperatura do superfusado do banho para ~35-37 °C.</li>
	<li>Conecte a cânula à bomba de servo. Leia a pressão exibida no controlador de servo de pressão.</li>
	<li>Monitore o fluxo e a pressão. A pressão de fluxo (μL/min) e a perfusão arterial (mm Hg) é digitalizada por digitalização por digitalização e registrada por meio de um software associado(Figura 2).</li>
	<li>Ajuste o fluxo para definir a pressão ~10 mmHg e deixe-a funcionar por ~10 min.</li>
	<li>Aumente o fluxo da solução luminal para fazer a pressão da artéria ~60 mmHg. Obtenha a pressão final de perfusão da própria arteriola subtraindo a queda de pressão da cânula(Figura 3). NOTA: Se o modo "pressão" no controlador de servo de pressão for selecionado, a pressão luminal será definida ~60 mmHg para esses experimentos. Em seguida, monitore a mudança do fluxo.</li>
	<li>Deixe a amostra estabilizar por ~30-60 min monitorando os níveis de fluxo e/ou pressão. Um aumento gradual da pressão arterial é normalmente observado no início da perfusão após a canulação. Um novo estado estável será estabelecido por si só em cerca de 30 min(Figura 4).</li>
	<li>Inicie um experimento depois que a pressão de perfusão for estabilizada (em fluxo constante).</li>
</ol>7. Carregando a preparação com aglutina de germe de trigo fluorescente (WGA)
<ol><li>Prepare a solução da Tyrode contendo WGA conjugada Alexa-Fluor-488 adicionando 100 μg de WGA conjugada em 5 mL da solução de Tyrode.</li>
	<li>Alterne cuidadosamente o perfusato da solução normal de Tyrode para uma contendo WGA marcada fluorescentemente. É importante alternar cuidadosamente o perfusato para que não sejam introduzidas bolhas.</li>
	<li>Depois de ~30 minutos de perfusão WGA ou quando a solução WGA está prestes a acabar, mude o perfusado de volta para a solução normal de Tyrode.</li>
</ol>8. Imagem confocal de arterioles e capilares
<ol><li>Ligue o sistema de microscópio confocal do disco Nipkow.</li>
	<li>Use o microscópio para localizar a artéria septal usando um objetivo de baixa potência (4x) no modo de luz transmitido. NOTA: A artéria septal pode ser localizada seguindo a posição da cânula.</li>
	<li>Inicie a imagem confocal com o disco giratório confocal e escolha 488 nm laser de excitação, ampliação objetiva de 40x e ajuste a intensidade do laser e a taxa de amostragem (10 - 500 ms por imagem).</li>
	<li>Configure posições de imagem superior e inferior para o microscópio confocal para definir a faixa de imagem e digite os parâmetros para a imagem de pilha z.</li>
	<li>Defina o tamanho da etapa conforme recomendado para o sistema que está sendo usado ou defina o tamanho da etapa conforme desejado.</li>
	<li>Escolha as configurações de pilha z e/ou as configurações da série de tempo.</li>
	<li>Selecione ou defina uma nova pasta para armazenar a nova imagem.</li>
	<li>Clique em "Executar" para começar a gravar imagens para análise futura(Figura 5).</li>
</ol>9. Exemplo de experimento vasodilatador: vasodilatação induzida por pinácido (Vídeo 1).
<ol><li>Prepare a solução de estoque de pinácido (100 mM em DMSO) e armazenada a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque de pinácido para fazer a concentração final de pinácido 100 μM.</li>
	<li>Imagem do músculo papilar em baixa ampliação (objetivo 4x) para incluir a artéria septal e as artérias do ramo.</li>
	<li>Alterne a solução luminal para a solução contendo pinácido.</li>
</ol>10. Exemplo de experimentos de controle de fluxo sanguíneo: aumento da pressão arterial induzida por vasoconstritor ao fluxo constante(Figura 6)
<ol><li>Prepare a solução de estoque endotelina-1 (ET-1) e armazenada a -20 °C.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque ET-1 (10 μM) para fazer a concentração final de ET-1 10 nM.</li>
	<li>Regissão a pressão luminal com fluxo constante e imagem do músculo papilar.</li>
	<li>Alterne a solução luminal para a solução contendo ET-1.</li>
</ol>11. Exemplo de imagens capilares com pericílitos (Figura 7)
<ol><li>Sacrifique um rato transgênico NG2DsRedBAC, conforme descrito na seção 4 deste protocolo.</li>
	<li>Extrair o coração, cannular a artéria septal e carregar a amostra com Alexa-Fluor-488 conjugada WGA seguindo os protocolos 5-7.</li>
	<li>Imagem do músculo papilar a 488 nm e excitação de 560 nm, e 510-525 nm, 575-625 nm de emissão usando confocal. A pressão da arteriola será em torno de 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

No presente trabalho, introduzimos um método ex vivo notavelmente simples, mas altamente prático, para estudar a microcirculação coronariana no coração em condições fisiológicas. Este método foi modificado a partir de investigações mecânicas utilizando ratos2. A adição desafiadora foi a tecnologia de imagem com alta velocidade e alta resolução óptica. Nós, portanto, fomos capazes de aproveitar os sistemas avançados de imagem óptica que agora estão disponíveis comercialmente....

A regulação adequada do fluxo de pressão coronariana garante o suprimento sanguíneo suficiente ao coração para atender às suas demandas metabólicas1. No entanto, só recentemente ficou claro como o fluxo de pressão coronária é dinamicamente regulado no coração, apesar de extensos estudos que têm sido realizados in vivo e in vitro nas últimas décadas. Uma das razões é a dificuldade em estabelecer um modelo de trabalho fisiológico para tais estudos devido à constante batida do coração. Independentemente disso, uma variedade de métodos foram estabelecidos para a observação dos micro-vasos coronários em tecidos ou animais vivos, mas nenhum desses métodos foi capaz de alcançar foco constante/estável e as medidas da pressão, fluxo e diâmetro microvascular ao mesmo tempo2,3. A visualização direta de micropescos arteriais coronárias no coração pulsante foi introduzida décadas atrás4,3, mas as medidas de diâmetro em pequenos vasos foram desafiadoras e as funções específicas dos muitos tipos de células especializadas associadas à microcirculação foram igualmente vexato. Mesmo o método estromacópico e o sistema objetivo flutuante não puderam fornecer as informações acima simultaneamente5. No entanto, uma quantidade significativa de informações valiosas foi obtida utilizando-se as tecnologias acima mencionadas, que nos ajudaram a entender mais sobre a regulação do fluxo sanguíneo coronário6. O método que estamos descrevendo neste artigo ajudará a investigar e entender detalhadamente como os componentes das artérias coronárias, das artérias e da microvasculatura respondem de forma diferente às estimulações e demandas metabólicas.
O modelo de trabalho que estabelecemos para prosseguir esses estudos foi construído sobre o trabalho anterior de Westerhof et al.2. Após a cannulação da artéria septal do coração do camundongo, a solução fisiológica salina foi usada para perfundir essa artéria para manter os miócitos e outros componentes do tecido cardíaco nutridos. A pressão arterial de perfusão, o fluxo e o diâmetro vascular foram monitorados entre outras funções fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes adequados. Este método nos permite visualizar o leito microvascular coronariano sob pressão fisiológica no tecido vivo e estudar os mecanismos celulares subjacentes à regulação da microcirculação pela primeira vez.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope software</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller/water incubator</td>
			<td>FisherScientific, USA</td>
			<td>Isotemp 3016S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments, USA</td>
			<td>A1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom glass tubing</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1322A</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution Heater</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, Idaho, USA</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette/cannula holder</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>64-0981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#008241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread for tying blood vessels</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>THR-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
			<td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

O tom arterial coronário, juntamente com a abertura ou fechamento dos capilares, determinam em grande parte o fluxo sanguíneo para cardiomiócitos com pressão constante de perfusão. No entanto, é difícil monitorar as mudanças dinâmicas das artérias coronárias e dos capilares em todo o coração, principalmente devido ao seu movimento e espancamento sem parar. Aqui descrevemos um método que permite o monitoramento da taxa de perfusão arterial, pressão e as alterações de diâmetro das artérias e capilares nos músculos papilares ventriculares do mouse direito. A artéria septal do rato é cânulada e perfundida em um fluxo ou pressão constante com a outra medida dinamicamente. Após a perfusão com uma lectina fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor-488 ou -633 rotulada de Agglutinina-Germe de trigo, WGA), as arterioles e capilares (e outros vasos) no músculo papilar e septo papirlículo do ventrículo direito podem ser prontamente imagens. As alterações do diâmetro do vaso poderiam então ser medidas na presença ou ausência de contrações cardíacas. Quando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas foram expressas, características específicas poderiam ser monitoradas. Por exemplo, pericítos foram visualizados em corações de camundongos que expressavam NG2-DsRed. Este método forneceu uma plataforma útil para estudar as funções fisiológicas dos pericítos capilares no coração. Também é adequado para estudar o efeito dos reagentes no fluxo sanguíneo no coração, medindo o diâmetro vascular/capilar e a pressão luminal arterial simultaneamente. Esta preparação, combinada com um sistema de imagem óptica de última geração, permite estudar o fluxo sanguíneo e seu controle a nível celular e molecular no coração em condições quase fisiológicas.

Quando um marcador vascular de fluorescência é perfumado em lúmen vascular (aqui WGA conjugado com Alexa Fluor-488), é possível visualizar árvores vasculares inteiras como mostrado na Figura 5 (painel esquerdo) usando microscópio confocal de alta velocidade. A ampliação adicional permite a imagem capilar em detalhes(Figura 5, Painel Direito). Uma vez que o sistema pressurizado suporta um monitoramento constante da pressão luminal, esta preparação pod...

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Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

5.3K visualizações.  University of Maryland School of Medicine. Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Vídeo: Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualization quantitativos e Detecção de Câncer de Pele Usando imagens térmicas dinâmico

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Não-invasivo de medição óptica do metabolismo cerebral e Hemodinâmica em Lactentes

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Ressonância magnética e PET no rato modelos de Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnóstico Ecografia de função de mouse Diafragma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Análise quantitativa [18F]-NAF-PET-RM para avaliação da rotatividade óssea dinâmica em paciente com dor nas costas Facetogênica

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolamento e purificação de Pericytes cardíacos murinos

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...