L'autore desidera ringraziare Steve Siegelbaum per il supporto. I finanziamenti sono forniti da 5R01NS106983-02 e 1 F31 NS113466-01.

L'autore non ha nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi in questo protocollo di affettamento progettato per promuovere la salute dei tessuti e favorire l'emergere di attività spontanea della rete naturalistica: il topo viene transcardially perfuso con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato; le fette di corteccia orizzontale-entorinale (HEC) sono tagliate ad uno spessore di 450 μm dall'ippocampo intermedio o ventrale; le fette si riprendono all'interfaccia dell'ACSF riscaldato e dell'aria umidificata ricca di carbogeni; durante le registrazioni le fette vengono sovrafuse con ACSF riscaldate a 32 °C e consegnate a una portata rapida con superfusione a doppia superficie in una camera di registrazione sommersa.
Slice health è di fondamentale importanza per la generazione di oscillazioni di rete in vitro. Gli animali giovani produrranno fette più sane e, generalmente, con topi giovani o adolescenti la fase di perfusione trascardica può essere saltata. Con l'invecchiamento degli animali, diventa sempre più difficile fare fette sane, ma alcune indagini (come modelli di malattia o studi longitudinali) richiedono l'uso di animali adulti o invecchiati. Dengler et al., ad esempio, hanno usato perfusioni trascardiali nella loro preparazione di fette di HEC da topi adulti cronicamente epilettici trattati con pilocarpina50. Con topi adulti, è utile eseguire una perfusione trascardica con soluzione di taglio del saccarosio refrigerato per raffreddare il tessuto, liberare il sangue dal cervello e ridurre l'attività metabolica prima di rimuovere il cervello dalcranio 51. È importante notare, tuttavia, che le perfusioni trascardiali richiedono una formazione corretta e occorre fare attenzione a garantire che la procedura venga eseguita rapidamente e in modo da non rappresentare un rischio per il benessere degli animali. Quando possibile, gli esperimenti dovrebbero essere concepiti in modo da utilizzare animali giovani in modo da impedire l'uso di perfusioni trascardiali. In una preparazione a fette non ottimale, non ci saranno abbastanza cellule sane, in particolare internanti, per supportare le oscillazioni di rete in corso. Per valutare la salute delle fette durante l'esperimento, è utile registrare prima i potenziali di campo evocati (ad esempio, con una pipetta di stimolazione e una pipetta di registrazione nello strato radiatum, SR). In una fetta sana, la stimolazione nello strato SR evocherà un grande potenziale postsinattico di campo (fPSP) con una raffica di fibre presnaptiche relativamente piccola (Figura 3).
Le fette prodotte da questo protocollo sono fette orizzontali orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC). È importante sottolineare che né l'inclusione del tessuto paraippocampale né il taglio angolato sono necessari affinché le fette ippocampali generino spontaneamente attività di rete come gli SWR. Infatti, molti studi hanno utilizzato fette ippocampali orizzontali o trasversali per interrogare aspetti fisiologici25,40,41,44 o oscillazioni patologiche della rete33,38. In questo protocollo il posizionamento del cervello su una rampa di agar consente allo sperimentatore di produrre selettivamente più fette dall'ippocampo ventrale o intermedio (Figura 1), che può essere utile per obiettivi sperimentali che tengono conto dell'eterogeneità funzionale che esiste lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo26,31. Se l'origine anatomica delle fette non è un fattore, allora la rampa dell'agar può essere esclusa e un vero piano di taglio orizzontale produrrà fette dell'ippocampo intermedio-ventrale. Man mano che ogni fetta di tessuto orizzontale viene liberata, la maggior parte delle parti estranee della fetta può essere rimossa con tre semplici tagli, lasciando una fetta approssimativamente rettangolare che contiene l'ippocampo e alcuni tessuti circostanti, compresa la regione paraippocampale (Figura 1). Un'ulteriore dissezione può essere eseguita per rimuovere tutti i tessuti extraippocampali, ma l'inclusione del tessuto circostante è benefica, in quanto l'arpa a fette può essere facilmente posizionata in modo tale che i filamenti di nylon non si riposino sull'ippocampo vero e proprio. Come discusso sopra, la fetta combinata hec è anche una preparazione utile con cui indagare una rete corticoippocampale più ampia nel contestofisiologico 37 opatologico 16,35,36,38 oscillazioni di rete.
Il fattore chiave di questo protocollo è ottimizzare l'apporto di ossigeno al tessuto, sia durante la fase di recupero che durante le registrazioni. Molti studi sulle oscillazioni di rete vengono eseguiti in fette che vengono trasferite direttamente dal microtomo a una camera di registrazione dell'interfaccia e permesso di recuperare con perfusione continua di ACSF fresco. Dopo diverse ore di recupero, le registrazioni possono quindi essere eseguite nella stessa camera di interfaccia. Pertanto, le fette sono tenute all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umida ricca di carbogeni per l'intera durata dell'esperimento. Nella metodologia alternativa presentata in questo protocollo, le fette si riprendono in una camera di tenuta in stile interfaccia per almeno due ore prima che le singole fette siano trasferite in una camera di registrazione in stile sommerso con portate ACSF sufficientemente veloci. Le fette preparate in queste condizioni possono presentare oscillazioni gamma stabili12 o attività spontanea di CFA43. Il recupero delle fette in una camera di tenuta in stile interfaccia è un passo critico: Maier et al. Allo stesso modo, Hájos et al. Durante il periodo di registrazione, la superfusione a doppia superficie non è strettamente necessaria, a condizione che la camera di registrazione consecchi un volume relativamente piccolo di ACSF erogato a una portata rapida (almeno 6 mL/min)43. La camera di registrazione stampata in 3D presentata in questo protocollo (Figura 2B) è un'opzione relativamente economica e semplice, ma ci sono anche camere di registrazione sommerse disponibili in commercio progettate per contenere volumi più piccoli, promuovere il flusso laminare dei supporti o fornire una superfusione a doppia superficie (a differenza delle camere di registrazione circolari, ad esempio, che consentono un volume morto in eccesso di ACSF).
Mentre questo protocollo consente di registrare oscillazioni di rete senza il requisito di una camera di registrazione dell'interfaccia tradizionale, ci sono diverse limitazioni. Sebbene le fette siano tenute nell'interfaccia ACSF-air durante il periodo di recupero, non ricevono una perfusione continua di supporti freschi come avviene nelle tradizionali camere di registrazione dell'interfaccia in stile Haas. Le fette devono essere trasferite singolarmente (utilizzando forcep sottili) dalla camera di recupero alla camera di registrazione sommersa. Inoltre, le portate veloci possono causare instabilità e artefatti di movimento problematici per alcune registrazioni, in particolare se ACSF viene fornito con una pompa peristaltica. Al fine di mantenere portate elevate e ridurre al minimo i disturbi meccanici, è possibile integrare nel sistema di perfusione un semplice smorzatore dipulsazione (Figura 2). Questo smorzatore di pulsazione funziona utilizzando l'effetto Windkessel52, in cui le siringhe vuote contengono sacche d'aria che fungono da serbatoi elastici, assorbendo la pressione fluttuante generata dai rulli della pompa peristaltica53. Tuttavia, l'incorporazione di uno smorzatore di impulsi può aggiungere lunghezza al tubo che fornisce ACSF alla camera di registrazione e influire sull'alimentazione dell'ossigeno alla fetta. Le portate devono essere solo il più velocemente possibile per produrre oscillazioni di rete stabili e, se viene utilizzata una pompa peristaltica, dovrebbe idealmente essere una pompa che utilizza un gran numero di rulli (> 12) per ridurre al minimo la pulsazione causata dalla peristalisi, impedire l'uso di uno smorzatore di pulsazione e assicurarsi che il tubo che fornisce ACSF alla camera di registrazione sia il più breve possibile. Le registrazioni eseguite con portate elevate richiedono anche grandi volumi di ACSF, il che può essere problematico se gli esperimenti richiedono l'aggiunta di farmaci o composti preziosi o costosi ai media. Sebbene una camera di superfusione a doppia superficie richieda una camera di registrazione appositamente costruita con due insenature di fluido per fornire mezzi ossigenati su entrambi i lati della fetta, si possono osservare oscillazioni spontanee della rete con portate ACSF moderate48. Questo protocollo utilizza sia una portata rapida (stabilizzata con uno smorzatore di pulsazione) che una camera di superfusione a doppia superficie per migliorare la probabilità di osservare l'attività spontanea.
Infine, questo protocollo ha una bassa resa per quanto riguarda il numero di fette prodotte per animale. L'affettare orizzontalmente con uno spessore di 450 μm produce un piccolo numero di fette di HEC all'orientamento preferito (in cui la fetta è effettivamente parallela all'asse trasversale dell'ippocampo). Di queste fette, tipicamente, solo una o due per ippocampi mostrano attività spontanea di CFA, meno di quanto riportato altrove43. Sebbene le fette più spesse contengano presumibilmente un maggior grado di connettività ricorrente, il taglio di fette leggermente più sottili (400 μm) può produrre un numero maggiore per mouse di fette orientate trasversalmente con attività SWR. Inoltre, la probabilità che più fette mostrino in modo affidabile un'attività spontanea di CFA può essere più alta negli esperimenti che utilizzano vere fette angolate orizzontali o verso il basso dell'ippocampo ventrale. L'attuale protocollo incorpora l'uso di fette orizzontali angolate verso l'alto dell'ippocampo intermedio, che potrebbero avere meno probabilità di mostrare attività spontanea di rete rispetto alle fette dell'ippocampo ventrale25,26,31. Infine, questo protocollo ha usato fette di topi adolescenti e adulti. Mentre le perfusioni trascardiali possono migliorare la qualità delle fette di animali più anziani, la probabilità di osservare attività spontanee di rete può essere miglioratadall'uso di fette di animali più giovani 12,41,44.
In sintesi, questo protocollo presenta un approccio di affettare il cervello del topo che produce fette orizzontali angolate di corteccia ippocampale-entorinale dalla formazione ippocampale intermedia o ventrale che può mostrare una complessa attività spontanea di rete sotto forma di complessi acuti di ondate-increspature.

La misurazione elettrofisiologia da fette ippocampali viventi in vitro è un potente approccio sperimentale con numerosi vantaggi. Lo sperimentatore può usare un microscopio, micromanipolatori e un sistema di registrazione per visualizzare e raccogliere direttamente le misurazioni dai singoli neuroni nel tessuto. Le fette di tessuto sono anche molto accessibili alla fotostimolazione o alla somministrazione di farmaci per esperimenti optogenetici, chemiogenetici o farmacologici.
La rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincrona in vivo,visibile come oscillazioni nel potenziale di campo locale extracellulare1,2,3,4,5. I metodi delle fette cerebrali sono stati sfruttati per ottenere informazioni sui meccanismi cellulari e di circuito alla base di queste oscillazioni della rete neuronale. ha dimostrato che i complessi a catena d'onda affilati (SWR) possono emergere spontaneamente in fette dell'ippocampo ventrale6,7. Studi successivi di più ricercatori hanno gradualmente chiarito molti aspetti degli SWR, tra cui il ruolo dei neuromodulatori nella regolazione dello stato di rete dell'ippocampo8,9,10 e i meccanismi sinaptici che guidano la riattivazione in vitro di insiemi neuronali precedentemente attivi durante il comportamento in vivo11. Gli esperimenti sulle fette cerebrali hanno anche fornito informazioni sull'oscillazione dell'intervallo gamma (30-100 Hz), un distinto stato della rete ippocampale che si ritiene supporti la codifica dellamemoria e richiami 12,13. Infine, riconoscendo il ruolo centrale dell'ippocampo e delle strutture associate nella fisiopatologia dell'epilessia del lobo temporale14,15, i ricercatori hanno utilizzato preparati a fette ippocampali per indagare la generazione e la propagazione dell'attività epileptiforme. carter et al. Successivamente, Karlócai et al. 
Gli investigatori hanno sviluppato numerosi approcci a fette ippocampali che differiscono in modi chiave: (1) la regione dell'ippocampo contenuta nella fetta (dorsale, intermedia o ventrale); 2) la presenza o l'assenza di tessuti extraippocampali come la corteccia entorinale; (3) l'orientamento utilizzato per tagliare le fette (coronale, sagittale, orizzontale o obliquo); e (4) le condizioni in cui il tessuto viene mantenuto dopo l'affezione (immerso completamente in ACSF o tenuto all'interfaccia dell'ACSF e dell'aria umidificata ricca di carbogeni).
La scelta dell'approccio di affezione all'uso dovrebbe essere determinata dall'obiettivo sperimentale. Ad esempio, fette trasversali o coronali dell'ippocampo dorsale mantenute in condizioni sommerse sono state utilizzate in modo molto efficace per lo studio dei circuiti intraippocampali e della plasticità sinaptica18,19,20. Tuttavia, tali preparati non generano spontaneamente oscillazioni di rete così prontamente come fette dall'ippocampo ventrale21,22,23. Sebbene uno stato di attività persistente di CFA possa essere indotto dalla stimolazione tetanica in fette trasversali dall'ippocampo dorsale e ventrale24, gli SWR spontanei sono più facilmente osservati nelle fetteventrali 7,25.
Una distinzione fisiologica e anatomica intrinseca tra l'ippocampo dorsale e ventrale è supportata da studi eseguiti sia in vivo che in vitro26. Le registrazioni nei ratti rivelarono ritmi di theta fortemente coerenti in tutto l'ippocampo dorsale e intermedio, ma scarsa coerenza tra la regione ventrale e il resto dell'ippocampo27. Gli SWR in vivo si propagano prontamente tra l'ippocampo dorsale e intermedio, mentre gli SWR che hanno origine nell'ippocampo ventrale rimangono spessolocali 28. Le proiezioni associativa provenienti dai neuroni piramidali CA3 che risiedono nell'ippocampo dorsale e intermedio proiettano lunghe distanze lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo. Le proiezioni CA3 provenienti dalle regioni ventrali rimangono relativamente locali e quindi hanno meno probabilità di essere recise durante il processo diaffezione 29,30. Le fette ventrali possono quindi preservare meglio la rete ricorrente necessaria per generare sincronia della popolazione. La propensione delle fette ventrali a generare attività spontanee di rete in vitro può anche riflettere una maggiore eccitabilità intrinseca dei neuroni piramidali o un'inibizione GABAergica più debole nell'ippocampo ventrale rispetto alle regioni più dorsali31. Infatti, le fette ippocampali ventrali sono più suscettibili all'attività epileptiforme32,33. Così, molti studi di spontaneafisiologica 8,9,11,24 opatologica 16,34,35,36 oscillazioni di rete hanno tradizionalmente utilizzato un approccio di affettare orizzontale, a volte con un leggero angolo nella direzione fronto-occipitale, che produce fette di tessuto parallele al piano trasversale dell'ippocampo ventrale.
La connettività di rete è inevitabilmente influenzata dalla procedura di affettare il numero di celle nella sezione che verrà recisa. L'angolo e lo spessore della fetta e del tessuto trattenuti nella preparazione devono essere considerati per ottimizzare la connettività nei circuiti di interesse. Molti studi hanno utilizzato fette orizzontali combinate di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) per esplorare le interazioni tra le due strutture nel contesto di oscillazioni fisiologiche o patologiche della rete. ha eseguito due registrazioni dal sottocampo CA1 dell'ippocampo e dallo strato V della corteccia entorinale mediale per dimostrare la propagazione dell'attività SWR attraverso la fettaHEC 37. Molti studi sull'attività epileptiforme hanno utilizzato la preparazione della fetta HEC per indagare come le scariche epileptiformi si propagano attraverso la rete corticoippocampale16,35,36,38. È importante notare che la conservazione dell'anello corticoippocampale intatto non è un prerequisito per gli SWR spontanei, le scariche epileptiformi o le oscillazioni gamma; le oscillazioni di rete possono essere generate in fette trasversali dell'ippocampo dorsale o ventrale senza tessuti paraippocampaliattaccati 21,22,23, 25,39,40,41. Un fattore più importante per la generazione spontanea di oscillazioni di rete nelle fette ippocampali può essere lo spessore di ogni fetta, poiché una fetta più spessa (400-550 μm) conserverà una maggiore connettività nella rete ricorrente CA2/ CA321,22,25.
Sebbene siano state utilizzate fette orizzontali angolate di HEC (tagliate con un angolo di circa 12° nella direzione fronto-occipitale) per studiare la connettività funzionale dell'anello corticoippocampale11,16,34,35,42,tali preparati angolati non sono necessari per l'attività spontanea della rete43,44,45. Tuttavia, l'uso di un piano di affettare angolato consente allo sperimentatore di creare selettivamente fette che preservano al meglio le lamelle orientate trasversalmente dell'ippocampo ventrale o intermedio, a seconda che si applica un angolo verso il basso o verso l'alto (Figura 1). Questo approccio è concettualmente simile a quello usato da Papatheodoropoulos et al., 2002, che ha sezionato ogni ippocampo libero e poi ha usato un elicottero tissutale per creare fette trasversali lungo l'intero asse dorsale-ventrale21. Alla luce delle suddette distinzioni funzionali tra l'ippocampo ventrale e dorsale-intermedio, gli investigatori dovrebbero considerare l'origine anatomica delle fette quando progettano esperimenti o interpretano i risultati. L'uso di una rampa di agar durante la procedura di affettare è un modo semplice per produrre preferenzialmente fette dall'ippocampo intermedio o ventrale.
Le fette ippocampali possono essere mantenute in una camera sommersa (con il tessuto completamente immerso in ACSF), o in una camera in stile interfaccia (ad esempio, camera Oslo o Haas, con fette coperte solo da una sottile pellicola di mezzi fluenti). La manutenzione dell'interfaccia migliora l'ossigenazione del tessuto, che promuove la sopravvivenza neuronale e consente alti livelli sostenuti di attività internauronale. Tradizionalmente, le condizioni di registrazione sommerse utilizzano una portata ACSF più lenta che non fornisce un'adeguata ossigenazione dei tessuti per l'espressione stabile delle oscillazioni a livello di rete. Nelle fette ippocampali sommerse le oscillazioni gamma indotte da carbacholo si osservano transitoriamentesolo 46,47, mentre possono essere mantenute stabilmente nelle camere di registrazionedell'interfaccia 10,48,49. Come tale, molti studi di attività spontanea complessa in vitro si sono affidati a camere di registrazione dell'interfaccia per indagarei complessi di increspature a onde acuti6,7,8,9,10,25,37, oscillazioni gamma10,13e attività epileptiforme16,38,45,47.
In una camera di registrazione in stile sommerso, un obiettivo di microscopio ad immersione può essere utilizzato per visualizzare singole cellule e indirizzare selettivamente cellule dall'aspetto sano per le registrazioni. La preparazione sommersa consente anche un controllo fine sull'ambiente cellulare, poiché l'immersione facilita la rapida diffusione di farmaci o altri composti nel tessuto. Pertanto, una metodologia modificata in cui le oscillazioni di rete stabili vengono mantenute in condizioni sommerse rappresenta un potente approccio sperimentale. Questo approccio è esemplificato dal lavoro di Hájos et al., in cui le fette ippocampali si riprendono in una camera di tenuta semplificata in stile interfaccia per diverse ore prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa modificata con un'elevata portata di ACSF (~ 6 mL / min) per migliorare l'apportodi ossigeno al tessuto 12,48,49. In queste condizioni, alti livelli di attività internauron e oscillazioni spontanee stabili della rete possono essere mantenuti in una camera di registrazione sommersa. Questo approccio modificato consente agli investigatori di eseguire registrazioni di patch clamp a celle intere guidate visivamente e caratterizzare il contributo dei tipi di cellule morfologicamente identificati alle oscillazioni gamma indotte da carbacholo12. Gli SWR possono anche verificarsi spontaneamente in fette ippocampali sommerse con una portata veloce di ACSF11,48,49. ha dimostrato che le fette ippocampali che si sono riprese in una camera di interfaccia prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano in modo affidabile SWR spontanei, mentre le fette che si riprendevano immerse in un becher prima del trasferimento in una camera di registrazione sommersa mostravano risposte di campo evocate più piccole, livelli inferiori di correnti sinaptiche spontanee e solo molto raramente mostravano SWRspontanei 43. ha utilizzato questa metodologia migliorata per dimostrare il ruolo delle cellule del cesto che esprimono parvalbumina nella generazione di SWR spontanei44.
Il seguente protocollo presenta un metodo di affettare attraverso il quale i neuroni spontaneamente attivi nelle fette ippocampali orizzontali possono essere recuperati in condizioni di interfaccia e successivamente mantenuti in una camera di registrazione sommersa adatta a manipolazioni farmacologiche o optogenetiche e registrazioni visivamente guidate.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

L'affezione acuta del cervello dei roditori offre un approccio sperimentale trattabile per ottenere informazioni sull'organizzazione e la funzione dei circuiti neurali con risoluzione a singola cellula utilizzando elettrofisiologia, microscopia e farmacologia. Tuttavia, una considerazione importante nella progettazione di esperimenti in vitro è la misura in cui diversi preparati a fette ricapitolano modelli naturalistici di attività neurale osservati in vivo. Nel cervello intatto, la rete ippocampale genera un'attività demografica altamente sincronizzata che riflette lo stato comportamentale dell'animale, come esemplificato dai complessi a catena a onde acuti (SWR) che si verificano durante gli stati consumatori di veglia o il sonno non REM. Gli SWR e altre forme di attività di rete possono emergere spontaneamente in fette ippocampali isolate in condizioni appropriate. Al fine di applicare il potente toolkit di fette cerebrali allo studio dell'attività della rete ippocampale, è necessario utilizzare un approccio che ottimizzi la salute dei tessuti e la conservazione della connettività funzionale all'interno della rete ippocampale. I topi sono perfusi transcardialmente con liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio freddo. Le fette orizzontali contenenti l'ippocampo vengono tagliate con uno spessore di 450 μm per preservare la connettività sinaptica. Le fette si riprendono in una camera in stile interfaccia e vengono trasferite in una camera sommersa per le registrazioni. La camera di registrazione è progettata per la doppia superfusione superficiale di liquido cerebrospinale artificiale ad alta portata per migliorare l'ossigenazione della fetta. Questo protocollo produce tessuti sani adatti allo studio di attività di rete complesse e spontanee in vitro.

Qui sono presentate registrazioni rappresentative da fette HEC preparate come descritto in questo protocollo. Dopo il recupero in una camera di tenuta dell'interfaccia (Figura 1C), le fette vengono trasferite singolarmente in una camera di registrazione sommersa (Figura 2B). La camera di registrazione viene fornita con ACSF saturo di carbogen utilizzando una pompa peristaltica (Figura 2A). La pompa estrae prima L'ACSF da un becher di tenuta in un serbatoio riscaldato. Le linee di carbogeno vengono posizionate sia nel becher di tenuta che nel serbatoio riscaldato per fornire un'ossigenazione continua del supporto. Uno smorzatore di pulsazione, costituito da una serie di siringhe riempite d'aria, è posizionato tra la pompa peristaltica e la camera di registrazione per ridurre al minimo le fluttuazioni della portata prodotte dalla rapida peristalisi. La tasca dell'aria in ogni siringa assorbe i cambiamenti di pressione causati da ogni ciclo della pompa, in modo che la camera di registrazione riceva un flusso fluido e coerente di ACSF52,53. Un riscaldatore in linea posizionato dopo lo smorzatore di pulsazione assicura che la temperatura dell'ACSF sia elevata a 32 °C quando entra nella camera di registrazione.
In questo esempio, la camera di registrazione a superfusione a doppia superficie è costituita da tre strati stampati in 3D (Figura 2B). Lo strato inferiore ha un ritaglio rettangolare per adattarsi a un coverslip, fissato con grasso sottovuoto. Lo strato intermedio contiene la metà inferiore di una camera ovale allungata, con due supporti orizzontali. Il filamento di nylon è infilato su questi supporti (all'incirca ogni 0,5 mm) e fissato con adesivo cianoacrilato. La fetta poggia su questo filamento infilato. Lo strato superiore contiene la metà superiore della camera ovale insieme a piccoli pozzi in cui è possibile posizionare i pellet macinati al cloruro d'argento. La forma ovale allungata della camera è progettata per promuovere un rapido flusso laminare di ACSF.
La figura 3 presenta le registrazioni rappresentative delle fette HEC preparate secondo questo protocollo. Per valutare inizialmente lo stato di salute delle fette, i potenziali postinaptici sul campo (fPSPs) vengono evocati nello strato radiatum (SR) usando una pipetta riempita con 1 M di NaCl. Nelle fette sane, la stimolazione elettrica dovrebbe produrre un fPSP con una piccola raffica di fibre presnaptiche e un grande potenziale postssinattico con una rapida discesa iniziale(Figura 3B, in altoa sinistra). Nelle fette sane, le increspature spontanee ad onda acuta (SWR) sono visibili come deformazioni positive nella LFP nello strato pyramidale (Figura 3B, inbasso a sinistra). Nelle fette non ottili evocate gli FPSP mostrano una grande raffica di fibre e un potenziale postssinattico relativamente piccolo, e tali fette non mostrano SWR spontanei(Figura 3B, adestra). Gli SWR in vitro mostrano caratteristiche coerenti con le descrizioni pubblicate: un potenziale di campo positivo nello strato SP con un'oscillazione ad alta frequenza sovrapposta, abbinato a un potenziale di campo negativo nello strato SR (Figura 3C). Un singolo CFA registrato in CA2 è indicato con un asterisco (Figura 3C, destra). Gli SWR nelle sezioni HEC hanno origine all'interno di circuiti ricorrenti CA2/CA3 e si propagano a CA1. Un singolo CFA osservato nello strato CA2 e CA1 SP è indicato con un asterisco (Figura 3D, destra). In questo esempio rappresentativo, il CA2 SWR (verde) lo porta in CA1 (blu) di diversi millisecondi, come mostrato nella sovrapposizione dell'inviluppo SWR (filtrato a 2-30 Hz) registrato in ogni regione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61704/61704fig1.jpg"> Figura 1: Preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale angolata (HEC). ( A )La commissione per l'agricoltura, la (i) Dopo aver estratto il cervello, eseguire due tagli coronali con una lama di rasoio per rimuovere le porzioni posteriori e anteriori del cervello. (ii) La rampa di agar è formata da due porzioni angolate incollate alla piattaforma di affettamento dei microtomi. Per preparare fette dell'ippocampo intermedio, posizionare il blocco cerebrale sulla rampa dell'agar con la superficie anteriore rivolta verso l'alto del pendio e prendere contatto con l'alta porzione di supporto della rampa. Per preparare fette di ippocampo più ventrale, posizionare il blocco cerebrale sulla rampa dell'agar con la superficie anteriore rivolta verso il basso lungo il pendio, in modo che la superficie di taglio posteriore faccia contatto con l'alta porzione di supporto della rampa. (iii) Man mano che ogni fetta viene liberata, eseguire molti altri tagli con il bisturi per separare gli emisferi e rimuovere i tessuti non necessari. (B) Immagine rappresentativa della fetta risultante con nuclei cellulari etichettati da DAPI. (C) In una camera di recupero dell'interfaccia, le fette sono posizionate su pezzi di carta per lenti sopra una rete in acciaio inossidabile o nylon, livellate con la superficie dell'ACSF. Un bubbler in ceramica trasmette carbogeno nella camera e una barra di agitazione magnetica mescola continuamente il fluido nella camera. Una sottile pellicola di ACSF copre la superficie superiore della fetta, migliorando la diffusione dell'ossigeno dall'aria umida ricca di carbogeni della camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61704/61704fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61704/61704fig2.jpg"> Figura 2: Camera di registrazione a doppia superfusione superficiale con smorzatore di pulsazione nei tubi di erogazione ACSF. (A) Diagramma del sistema di superfusione. L'ACSF viene riscaldato a 32 °C, costantemente bollito con gas carbogeno e consegnato a circa 8-10 mL/min utilizzando una pompa peristaltica con uno smorzatore di pulsazione costituito da una serie di siringhe riempite d'aria. (B) La camera di registrazione è costituita da tre strati stampati in 3D, il cui centro è infilato con filamento di nylon. La fetta poggia su questo filamento infilato e L'ACSF scorre sopra e sotto il tessuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61704/61704fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61704/61704fig3.jpg"> Figura 3: Registrazioni rappresentative di increspature spontanee ad onda acuta da fette HEC. (A) Diagramma semplificato della fetta di HEC che mostra le posizioni degli elettrodi di registrazione e stimolazione. (B) Registrazioni rappresentative dell'attività LFP sia da una fetta attiva e sana che da una fetta non ottimale. La fetta sana (a sinistra, in verde) mostra grandi risposte di campo evocate e increspature spontanee di onde affilate (SWR), visibili come deviazioni positive che si verificano irregolarmente nel potenziale di campo locale dello strato SP. Al contrario, una fetta malsana mostra piccole risposte di campo evocate e nessuna attività spontanea (a destra, in grigio). (C) Registrazioni rappresentative degli SWR nella regione CA2, costituite da una deflessione negativa nella LFP nello strato SR e da un'oscillazione ad alta frequenza con una deflessione positiva sottostante nella LFP nello strato SP. I picchi in ogni canale superiori a tre deviazioni standard dell'ampiezza del segnale sono evidenziati in rosso. Un filtro passa banda di 2-30 Hz isola l'inviluppo positivo e negativo sottostante dell'onda acuta nello strato SP e SR, rispettivamente, mentre un filtro passa banda di 80-250 Hz viene utilizzato per isolare l'oscillazione ad alta frequenza dell'increspatura nello strato SP. (D) Gli SWR si propagano in vitro da CA2/CA3 a CA1. In queste registrazioni rappresentative, gli SWR in CA2 (verde, inferiore) lo precedono in CA1 (blu, superiore) di diversi millisecondi. I picchi in ogni canale superiori a tre deviazioni standard dell'ampiezza del segnale sono evidenziati in rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61704/61704fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>peso molecolare (grammi / mol)</td>
			<td>concentrazione finale (mM)</td>
			<td>grammi / soluzione di taglio del saccarosio da 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccarosio</td>
			<td>C12H22O11
</td>
			<td>342.3</td>
			<td>195</td>
			<td>66.749</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di sodio</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>10</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>C6H12O6
</td>
			<td>180.08</td>
			<td>10</td>
			<td>1.801</td>
		</tr>
<tr>
<td>bicarbonato di sodio</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>25</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di potassio</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.186</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfato di sodio monobasico anidro</td>
			<td>NaH2PO4
</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>piruvato di sodio</td>
			<td>C3H3NaO3
</td>
			<td>110.04</td>
			<td>2</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrazione delle scorte (M)</td>
			<td>concentrazione finale (mM)</td>
			<td>millilitri / soluzione di taglio del saccarosio 1L</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di calcio</td>
			<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di magnesio</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>1</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Composizione della soluzione di taglio del saccarosio. Iniziare con circa 0,75 L di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Sciogliere ogni solido mescolando la soluzione con una barra di agitazione magnetica. Una volta sciolti tutti i solidi, il gas carbogeno a bolle attraverso la soluzione per 10 minuti. Aggiungere le soluzioni MgCl2 e CaCl2 e aggiungere acqua per portare il volume totale a 1 L. Mescolare con una barra di agitazione magnetica per 10 minuti per assicurarsi che la soluzione sia miscelata uniformemente. L'osmolarità dovrebbe essere compresa tra 315 e 325 mOsm e il pH dovrebbe essere di circa 7,4.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>peso molecolare (grammi / mol)</td>
			<td>concentrazione finale (mM)</td>
			<td>grammi / 2L ACSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di sodio</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>125</td>
			<td>14.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>C6H12O6
</td>
			<td>180.08</td>
			<td>12.5</td>
			<td>4.502</td>
		</tr>
<tr>
<td>bicarbonato di sodio</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>25</td>
			<td>4.201</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di potassio</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>3.5</td>
			<td>0.522</td>
		</tr>
<tr>
<td>fosfato di sodio monobasico anidro</td>
			<td>NaH2PO4
</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1.25</td>
			<td>0.345</td>
		</tr>
<tr>
<td>acido ascorbico</td>
			<td>C6H8O6
</td>
			<td>176.12</td>
			<td>1</td>
			<td>0.352</td>
		</tr>
<tr>
<td>piruvato di sodio</td>
			<td>C3H3NaO3
</td>
			<td>110.04</td>
			<td>3</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>concentrazione delle scorte (M)</td>
			<td>concentrazione finale (mM)</td>
			<td>millilitri / 2L ACSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di calcio</td>
			<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
			<td>1.6</td>
			<td>3.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>cloruro di magnesio</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>1</td>
			<td>1.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Composizione del liquido cerebrospinale artificiale. Iniziare con circa 1,5 L di acqua purificata che è stata filtrata per rimuovere metalli traccia e altre impurità. Sciogliere ogni solido mescolando la soluzione con una barra di agitazione magnetica. Una volta sciolti tutti i solidi, il gas carbogeno a bolle attraverso la soluzione per 10 minuti. Aggiungere le soluzioni MgCl2 e CaCl2 e aggiungere acqua per portare il volume totale a 2 L. Mescolare con una barra di agitazione magnetica per 10 minuti per assicurarsi che la soluzione sia miscelata uniformemente. L'osmolarità dovrebbe essere compresa tra 315 e 325 mOsm e il pH dovrebbe essere di circa 7,4.

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  Columbia University. Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Video: Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

La combinazione di stimolazione magnetica transcranica e fMRI per esaminare il modo predefinito della rete

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Ricerca

Neuroscienze

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

L&#39;induzione di uno Stato Isoelectric cervello per studiare l&#39;impatto di endogeno Synaptic attività su NEURONALE<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modello preclinico per valutare il recupero del cervello dopo l'ictus acuto nei ratti

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...