L’auteur tiens à remercier Steve Siegelbaum pour son soutien. Le financement est fourni par 5R01NS106983-02 ainsi que par 1 F31 NS113466-01.

L’auteur n’a rien à divulguer.

Il y a plusieurs étapes dans ce protocole de tranchage conçus pour favoriser la santé des tissus et favoriser l’émergence de l’activité spontanée du réseau naturaliste : la souris est transcardially perfusée avec la solution de coupe de saccharose réfrigérée ; les tranches de cortex horizontal-entorhinal (HEC) sont coupées à une épaisseur de 450 μm de l’hippocampe intermédiaire ou ventral ; les tranches se rétablissent à l’interface de l’ACSF réchauffé et de l’air humidifié et riche en ca...

La mesure électrophysiologique à partir de tranches hippocampiques vivantes in vitro est une approche expérimentale puissante avec de nombreux avantages. L’expérimentateur peut utiliser un microscope, des micromanipulateurs et un système d’enregistrement pour visualiser et recueillir directement les mesures des neurones individuels dans le tissu. Les tranches de tissu sont également très accessibles à la photostimulation ou à l’administration de médicaments pour des expériences optogénétiques, chimiogénétiques ou pharmacologiques.
Le réseau hippocampal génère une activité de population hautement synchrone in vivo, visible sous forme d’oscillations dans le potentiel extracellulaire du champ local1,2,3,4,5. Des méthodes de tranche de cerveau ont été leveraged pour obtenir l’aperçu des mécanismes cellulaires et de circuit sous-jacents à ces oscillations neuronales de réseau. Les travaux de base de Maier et coll. ont démontré que des complexes pointus d’ondulation d’onde (SWRs) peuvent émerger spontanément dans des tranches de l’hippocampe ventral6,7. Les études suivantes de plusieurs investigateurs ont graduellement élucidé beaucoup d’aspects des SWRs, y compris le rôle des neuromodulateurs en réglementant l’état de réseau de l’hippocampe8,9,10 et les mécanismes synaptiques qui conduisent la réactivation in vitro des ensembles neuronaux précédemment actifs pendant le comportement in vivo11. Les expériences de tranche de cerveau ont également fourni un aperçu de l’oscillation de gamme gamma (30-100 Hz), un état distinct de réseau hippocampal censé soutenir l’encodage de mémoire et lerappel 12,13. Enfin, reconnaissant le rôle central de l’hippocampe et des structures associées dans la pathophysiologie de l’épilepsie du lobe temporal14,15, les chercheurs ont utilisé des préparations de tranches hippocampiques pour étudier la génération et la propagation de l’activité épileptiforme. Carter et coll. ont démontré que les tranches combinées du cortex hippocampal-entorhinal préparées à partir d’animaux épileptiques chroniques peuvent générer spontanément des décharges épileptiformes in vitro16. Par la suite, Karlócai et coll. ont exploré les mécanismes sous-jacents aux rejets épileptiformes dans les tranches hippocampiques en utilisant du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié (ACSF) avec des concentrations d’ion altérées (mg2+ réduit ou K+élevé) ou des médicaments ajoutés (4AP ou gabazine)17.
Les chercheurs ont mis au point de nombreuses approches de tranches hippocampiques qui diffèrent de façon clé : (1) la région de l’hippocampe contenue dans la tranche (dorsale, intermédiaire ou ventrale); (2) la présence ou l’absence de tissus extrahippocampal tels que le cortex entorhinal ; (3) l’orientation utilisée pour couper les tranches (coronale, sagittale, horizontale ou oblique); et (4) les conditions dans lesquelles le tissu est maintenu après le tranchage (immergé entièrement dans l’ACSF ou maintenu à l’interface de l’ACSF et de l’air humidifié et riche en carbogen).
Le choix de l’approche de tranchage à utiliser doit être déterminé par l’objectif expérimental. Par exemple, des tranches transversales ou coronaires de l’hippocampe dorsal maintenus dans des conditions submergées ont été employées très efficacement pour l’étude des circuits intrahippocampal et de la plasticité synaptique18,19,20. Cependant, de telles préparations ne génèrent pas spontanément des oscillations réseau aussi facilement que les tranches de l’hippocampe ventral21,22,23. Bien qu’un état d’activité persistante de SWR puisse être induit par la stimulation tétanos dans les tranches transversales de l’hippocampe dorsal et ventral24,les SWRs spontanés sont plus facilement observés dans les tranches ventrales7,25.
Une distinction physiologique et anatomique inhérente entre l’hippocampe dorsal et ventral est soutenue par des études exécutées in vivo et in vitro26. Les enregistrements chez les rats ont indiqué des rythmes fortement cohérents de theta dans tout l’hippocampe dorsal et intermédiaire, pourtant la cohérence pauvre entre la région ventrale et le reste de l’hippocampe27. Les RSF in vivo se propagent facilement entre l’hippocampe dorsal et intermédiaire, tandis que les RS qui proviennent de l’hippocampe ventral demeurent souventlocaux 28. Les projections associationnelles provenant des neurones pyramidaux CA3 qui résident dans l’hippocampe dorsale et intermédiaire projettent de longues distances le long de l’axe longitudinal de l’hippocampe. Les projections de CA3 provenant de régions ventrales demeurent relativement locales et sont donc moins susceptibles d’être rompues au cours du processus detranchage 29,30. Les tranches ventrales peuvent donc mieux préserver le réseau récurrent nécessaire à la synchronisation de la population. La propension des tranches ventrales à générer des activités spontanées de réseau in vitro peut également refléter une excitabilité intrinsèque plus élevée des neurones pyramidaux ou une inhibition GABAergic plus faible dans l’hippocampe ventral par rapport aux régions plus dorsales31. En effet, les tranches hippocampales ventrales sont plus sensibles à l’activité épileptiforme32,33. Ainsi, de nombreuses études sur les oscillations physiologiquesspontanées 8,9,11,24 ou pathologiques16,34,35,36 oscillations réseau ont traditionnellement utilisé une approche horizontale de tranchage, parfois avec un léger angle dans la direction fronto-occipitale, qui donne des tranches de tissu parallèles au plan transversal de l’hippocampe ventral.
La connectivité réseau est inévitablement affectée par la procédure de tranchage car de nombreuses cellules de la tranche seront coupées. L’angle et l’épaisseur de la tranche et du tissu conservés dans la préparation doivent être considérés comme optimisant la connectivité dans les circuits d’intérêt. De nombreuses études ont utilisé des tranches horizontales combinées du cortex hippocampal-entorhinal (HEC) pour explorer les interactions entre les deux structures dans le contexte d’oscillations physiologiques ou pathologiques du réseau. Roth et coll. ont effectué des enregistrements doubles à partir du sous-champ CA1 de l’hippocampe et de la couche V du cortex entorhinal médial pour démontrer la propagation de l’activité swr par la trancheHEC 37. Beaucoup d’études de l’activité épileptiforme ont employé la préparation de tranche de HEC pour étudier comment les décharges épileptiformes propagent par le réseau corticohippocampal16,35,36,38. Il est important de noter que la conservation de la boucle corticohippocampal intacte n’est pas une condition préalable pour des SWRs spontanés, des décharges épileptiformes, ou des oscillations gamma ; les oscillations réseau peuvent être générées en tranches transversales de l’hippocampe dorsal ou ventral sans tissus parahippocampal attachés21,22,23, 25,39,40,41. Un facteur plus important pour la génération spontanée d’oscillations réseau en tranches hippocampiques peut être l’épaisseur de chaque tranche, car une tranche plus épaisse (400-550 μm) préservera plus de connectivité dans le réseau récurrent CA2/CA321,22,25.
Bien que des tranches horizontales inclinées de HEC (coupées avec un angle d’approximativement 12° dans la direction fronto-occipital) aient été employées pour étudier la connectivité fonctionnelle de la boucle corticohippocampal11,16,34,35,42,de telles préparations inclinées ne sont pas exigées pour l’activité spontanée de réseau43,44,45. Toutefois, l’utilisation d’un plan de découpage incliné permet à l’enquêteur de faire sélectivement des tranches qui préservent le mieux les lamellae orientées transversalement de l’hippocampe ventral ou intermédiaire, selon qu’un angle vers le bas ou vers le haut est appliqué (figure 1). Cette approche est conceptuellement semblable à celle utilisée par Papatheodoropoulos et coll., 2002, qui ont disséqué chaque hippocampe librement, puis utilisé un hachoir de tissu pour créer des tranches transversales le long de l’axe dorsal-ventralentier 21. À la lumière des distinctions fonctionnelles susmentionnées entre l’hippocampe ventral et dorsale-intermédiaire, les chercheurs devraient tenir compte de l’origine anatomique des tranches lors de la conception d’expériences ou de l’interprétation des résultats. L’utilisation d’une rampe d’agar pendant la procédure de tranchage est un moyen simple de produire préférentiellement des tranches de l’hippocampe intermédiaire ou ventral.
Les tranches hippocampiques peuvent être maintenues soit dans une chambre submergée (avec le tissu complètement immergé dans l’ACSF), soit dans une chambre de style interface (par exemple, chambre Oslo ou Haas, avec des tranches couvertes uniquement par un mince film de médias fluides). L’entretien de l’interface améliore l’oxygénation du tissu, ce qui favorise la survie neuronale et permet des niveaux élevés soutenus d’activité interuronale. Traditionnellement, les conditions d’enregistrement submergées utilisent un débit ACSF plus lent qui ne fournit pas une oxygénation adéquate des tissus pour l’expression stable des oscillations au niveau du réseau. Dans les tranches hippocampales submergées, les oscillations gamma induites par le carbachol ne sont observées quetransitoirement 46,47, alors qu’elles peuvent être maintenues de façon durable dans les chambres d’enregistrementd’interface 10,48,49. En tant que tel, de nombreuses études de l’activité spontanée complexe in vitro se sont appuyées sur des chambres d’enregistrement d’interface pour étudier les complexes d’ondulation à ondes vives6,7,8,9,10,25,37, oscillations gamma10,13, et l’activité épileptiforme16,38,45,47.
Dans une chambre d’enregistrement de style immergé, un objectif de microscope d’immersion peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et cibler sélectivement les cellules d’aspect sain pour les enregistrements. La préparation submergée permet également un contrôle fin sur le milieu cellulaire, car la submersion facilite la diffusion rapide de médicaments ou d’autres composés dans le tissu. Ainsi, une méthodologie modifiée dans laquelle les oscillations stables du réseau sont maintenues dans des conditions submergées représente une approche expérimentale puissante. Cette approche est illustrée par le travail de Hájos et coll., dans lequel les tranches hippocampiques se rétablissent dans une chambre de détention simplifiée de style interface pendant plusieurs heures avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée modifiée avec un débit élevé d’ACSF (~6 mL/min) pour améliorer l’approvisionnementen oxygène du tissu 12,48,49. Dans ces conditions, des niveaux élevés d’activité interneuronale et des oscillations spontanées stables du réseau peuvent être maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée. Cette approche modifiée permet aux chercheurs d’effectuer des enregistrements de pinces à patch à cellules entières guidées visuellement et de caractériser la contribution des types de cellules morphologiquement identifiés aux oscillations gamma induites par le carbachol12. Les RSR peuvent également se produire spontanément dans des tranches hippocampiques submergées avec un débit rapide de11,48,49. Maier et coll. ont démontré que les tranches hippocampiques qui se sont rétablies dans une chambre d’interface avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée présentaient de façon fiable des RS spontanés, tandis que les tranches qui se rétablissaient immergées dans un bécher avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée montraient des réponses plus petites sur le terrain évoquées, des niveaux inférieurs de courants synaptiques spontanés et seulement très rarement des SWRspontanés 43. Schlingloff et coll. ont utilisé cette méthodologie améliorée pour démontrer le rôle des cellules paniers exprimant la parvalbumine dans la génération de SRSspontanés 44.
Le protocole suivant présente une méthode de tranchage par laquelle les neurones spontanément actifs dans les tranches hippocampiques horizontales peuvent être récupérés dans des conditions d’interface et ensuite maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée adaptée aux manipulations pharmacologiques ou optogénétiques et aux enregistrements visuellement guidés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

Le tranchage aigu du cerveau des rongeurs offre une approche expérimentale tractable pour mieux comprendre l’organisation et la fonction des circuits neuronaux avec résolution à cellule unique à l’aide d’électrophysiologie, de microscopie et de pharmacologie. Cependant, une considération majeure dans la conception des expériences in vitro est la mesure dans laquelle différentes préparations de tranche récapitulent des modèles naturalistes de l’activité neuronale comme observé in vivo. Dans le cerveau intact, le réseau hippocampal génère une activité de population hautement synchronisée reflétant l’état comportemental de l’animal, comme en illustrent les complexes d’ondulation à ondes vives (SWR) qui se produisent pendant les états de consommation éveillés ou le sommeil non paradoxal. Les DTS et d’autres formes d’activité réseau peuvent émerger spontanément dans des tranches hippocampiques isolées dans des conditions appropriées. Afin d’appliquer la boîte à outils puissante tranche de cerveau à l’étude de l’activité du réseau hippocampal, il est nécessaire d’utiliser une approche qui optimise la santé des tissus et la préservation de la connectivité fonctionnelle au sein du réseau hippocampal. Les souris sont transcardially perfusées avec le fluide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose froid. Les tranches horizontales contenant l’hippocampe sont coupées à une épaisseur de 450 μm pour préserver la connectivité synaptique. Les tranches se rétablissent dans une chambre de style interface et sont transférées dans une chambre submergée pour les enregistrements. La chambre d’enregistrement est conçue pour la superfusion à double surface du liquide céphalo-rachidien artificiel à un débit élevé afin d’améliorer l’oxygénation de la tranche. Ce protocole donne des tissus sains adaptés à l’étude de l’activité réseau complexe et spontanée in vitro.

Présentés ici sont des enregistrements représentatifs de tranches HEC préparé tel que décrit dans ce protocole. Après récupération dans une chambre de détention d’interface (figure 1C), les tranches sont transférées individuellement dans une chambre d’enregistrement submergée (figure 2B). La chambre d’enregistrement est fournie avec acsf saturé de carbogen à l’aide d’une pompe périssaltique (Figure 2A). La ...

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Ce protocole décrit la préparation des tranches horizontales de cortex hippocampal-entorhinal (HEC) des souris présentant l’activité spontanée d’ondulation d’onde forte. Les tranches sont incubées dans une chambre de rétention d’interface simplifiée et les enregistrements sont effectués dans des conditions submergées avec un fluide céphalo-rachidien artificiel à écoulement rapide pour favoriser l’oxygénation des tissus et l’émergence spontanée de l’activité au niveau du réseau.

Le cerveau aigu de souris tranche pour étudier l’activité spontanée de réseau hippocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K vues.  Columbia University. Ce protocole décrit la préparation des tranches horizontales de cortex hippocampal-entorhinal (HEC) des souris présentant l’activité spontanée d’ondulation d’onde forte. Les tranches sont incubées dans une chambre de rétention d’interface simplifiée et les enregistrements sont effectués dans des conditions submergées avec un fluide céphalo-rachidien artificiel à écoulement rapide pour favoriser l’oxygénation des tissus et l’émergence spontanée ...

Vidéo: Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

Alliant la stimulation magnétique transcrânienne et l&#39;IRMf pour examiner le réseau en mode par défaut

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Recherche

Neurosciences

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Détermination de l&#39;activité locomotrice spontanée,<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: aiguë cerveau adulte trancher dans physiologique Température

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Visualisation immunohistochimique de l&#39;hippocampe Neuron Activité Après l&#39;apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

Induction d&#39;un Etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modèle préclinique pour évaluer le rétablissement du cerveau après un AVC aigu chez les rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Préparation de tranches d’hippocampe humaine aiguë pour les enregistrements électrophysiologiques

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...