O presente protocolo descreve uma medida de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função de junções endoteliais apertadas em glândulas submandibulares de camundongos. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Este experimento fornece uma boa medida de método para avaliar a permeabilidade vascular de diferentes tecidos, especialmente os tecidos superficiais e órgãos de animais.
Comece escolhendo marcadores apropriados, como fluoresceína, isotiocianato, dextrano marcado e rodamina B, dextran marcado com espectros distintos de emissões de excitação, para minimizar a interferência entre os sinais de fluorescência para o ensaio de permeabilidade. Diluir os vestígios em solução salina tamponada com fosfato estéril em estoques de 100 miligramas por mililitro e armazenar as alíquotas protegidas da luz a menos 20 graus Celsius. Depois de anestesiar o rato macho do tipo selvagem de 8 a 10 semanas de idade, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente.
Insira uma seringa de insulina contendo 100 microlitros de mistura de solução de marcador fluorescente ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho. Após a injeção, coloque rapidamente o rato sobre o cartão em decúbito dorsal com os membros e a cabeça adesivados. Para isolamento da glândula submandibular ou SMG, sob um microscópio estereoscópico, corte a epiderme do pescoço com tesouras de tecido geral para expor ambos os lados dos SMGs.
Em seguida, use uma agulha de separação de tecido contundente para separar suavemente a cápsula da superfície da glândula sem danificar o tecido da glândula, os vasos sanguíneos e a estrutura glandular. Conecte o suporte personalizado ao dispositivo de pressão negativa e verifique se o efeito de pressão negativa é adequadamente alcançado com antecedência. Coloque suavemente o SMG exposto no suporte personalizado e sugue o tecido por sucção por pressão negativa, o mais longe possível do corpo do rato, para reduzir os artefactos de movimento causados pela respiração e outras condições.
Comece a imagem logo após o local da glândula ser escolhido. Adquira imagens sequenciais ao longo do eixo Z a dois mícrons de distância da superfície da glândula até 70 a 140 mícrons no tecido para gerar uma construção tridimensional. Em seguida, adquira imagens de lapso de tempo dos vasos para medir a permeabilidade vascular no SMG.
Na caixa de diálogo Explorer, clique em Adicionar Nova Pasta" e altere o nome do arquivo. Em seguida, volte para a coluna de aquisição. Em XY, o formato é de 512 por 512, e a velocidade é de 400 hertz.
Ative o X"R bidirecional, defina o fator de zoom como 0,75 e 1,5 para zoom. Em seguida, selecione XYT em Modo de Aquisição "para adquirir imagens de lapso de tempo. Defina a duração para 20 segundos, 30 minutos ou mais, de acordo com a necessidade experimental.
Depois de definir as condições, clique em Live"para observar a imagem vascular de dois canais e canais sobrepostos no quadro de formação de fotos e escolha as áreas de interesse. Clique em Iniciar" para iniciar a geração de imagens. Ensaio de permeabilidade vascular in vivo e imagens tridimensionais de vasos sanguíneos em camundongos.
As glândulas submandibulares são mostradas aqui. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do SMG. Devido ao seu pequeno peso molecular, o FD4 foi capaz de vazar dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e ductos, descrevendo assim claramente a forma dos ácinos e ductos.
O RD70 foi distribuído em vasos sanguíneos de grande porte e microvasos. No grupo ligadura do ducto, tanto o FD4 quanto o RD70 foram extravasados para os lados basais dos ácinos, o que indicou que a ligadura do ducto poderia interromper a função de barreira endotelial e aumentar a permeabilidade a moléculas grandes. Além disso, os resultados semiquantitativos de intensidade de fluorescência FD4 e RD70 confirmaram essas observações.
As imagens tridimensionais mostraram fluorescência muito mais obscurecida de FD4 e RD70 ao redor dos vasos sanguíneos no grupo ligadura em comparação com o grupo controle. O isolamento cuidadoso do SMG e a colocação apropriada e o microscópio são pré-requisitos essenciais para uma detecção bem-sucedida. Após os procedimentos, a taxa de fluxo sanguíneo pode ser calculada casando o movimento dos glóbulos vermelhos e a infiltração das células sanguíneas marcadas com fluorescência pode ser perseguida.
