Nosso protocolo é o primeiro que permite a medição dinâmica do líquido superficial das vias aéreas, ou pH ASL, em tempo real, tanto sob repouso quanto após tratamento agonista ou inibidor. Este método ajuda a identificar canais de íons e transportadores envolvidos na regulação extracelular do pH e poderia ser aplicado a outros sistemas celulares nos quais isso é importante, como o câncer. Agora, em comparação com os métodos publicados anteriormente, esta nova técnica é relativamente simples de executar.
Não requer equipamento especializado. E pode fazer medições de pH ASL simultaneamente em várias culturas sob interface líquida de ar, ou condições de filme fino. É importante ressaltar que essa nova técnica tem potencial para avaliar os efeitos de novas terapêuticas, não apenas para a fibrose cística, mas também para outras doenças crônicas das vias aéreas, como asma e DPOC.
Após pelo menos 28 dias de cultura, lave a superfície apical de uma cultura epitelial das vias aéreas humanas com 150 microlitadores de bicarbonato contendo solução tampão Krebs por 20 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, use uma tubulação de vidro estéril com uma ponta estéril de tubulação P200 ligada a uma bomba de aspiração, para aspirar cuidadosamente a lavagem sem interromper o epitélio. Deve haver o mínimo de líquido restante na superfície apical possível para restaurar a interface líquida de ar.
Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por 30 minutos. Para realizar uma medição de fundo, ligue o leitor de placas e o computador. Depois de abrir o painel, clique em Faísca 10M e defina o controle de temperatura para 37 graus Celsius.
Em seguida, abra o controle do gás e coloque o dióxido de carbono em 5%Quando a temperatura e o gás atingirem seus alvos, abra a gaveta do leitor de placas e insira um de umidade cheio de seis mililitros de água destilada de cada lado no leitor. Confirme se a tampa e o fundo da placa de cultura celular estão limpos e coloque a placa no de umidade, coloque a tampa de volta e feche a gaveta. Abra o editor do Método de Centelha, selecione o modelo de placa apropriado e selecione os poços a serem monitorados durante o experimento.
Adicione um painel de controle de temperatura e dióxido de carbono e coloque os painéis em 37 graus Celsius e 5%, respectivamente. Em seguida, marque a espera por caixas de temperatura/gás. Adicione um painel de loop cinético e selecione a duração como o tipo de loop.
Defina a duração para cinco minutos e defina o tipo de intervalo do experimento para não definir, para obter uma leitura contínua. Dentro do laço cinético, use a função arrastar e soltar para adicionar dois painéis de intensidade de fluorescência que serão definidos individualmente para os corantes fluorescentes insensíveis ao pH e pH. Defina o comprimento de onda de excitação e emissão para 560 e 590 nanômetros, respectivamente, para o corante sensível ao pH.
E 495 e 520 nanômetros, respectivamente, para o corante insensível pH. Ajuste o número de flashes para 30 e a posição z para 33,200 para cada fluoróforo. Defina a leitura múltipla por bem ao usuário definido, como um três por três por círculo com uma borda de 4.750 micrômetros.
Clique em iniciar a leitura de medição de fundo e clique bem, para confirmar se a tampa do de umidade está no lugar. No final da medição, transfira a placa do leitor de placas para um armário de segurança de cultura tecidual e adicione três microliters de solução de corante fluorescente recém-preparada para a superfície apical das células. Em seguida, devolva a placa para a incubadora de cultura celular durante a noite.
Para a medição da cinética, abra o arquivo de método utilizado para as medições de fundo. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abra a gaveta do leitor de placas e insira o de umidade. Coloque a placa limpa no de umidade com sua tampa e clique em iniciar as leituras de fluorescência.
Em seguida, clique bem, para confirmar que a tampa do de umidade está no lugar. Após um mínimo de 12 ciclos, clique em pausa para interromper o experimento e remova a placa para aplicar basolateralmente quaisquer drogas ou agonistas nas amostras apropriadas. Volte a placa para o de umidade na bandeja e reposicione a tampa do de umidade, antes de clicar continuar, para registrar ainda mais o pH ASL e monitorar o efeito do tratamento.
Para calibração in situ pH, remova a placa do leitor de placas e aspire a solução basolateral. Adicione 750 microliters de solução de curva padrão altamente tamponada ao compartimento basolateral e um microliter de solução à superfície apical. Desligue o dióxido de carbono no leitor da placa e devolva a placa ao de umidade.
Em seguida, defina o leitor de placas com os mesmos parâmetros demonstrados, mas sem dióxido de carbono, e inicie as leituras de fluorescência a cada cinco minutos por uma a uma hora e meia. Para análise de dados, selecione todos os dados médios para cada amostra e, ou condição para ambos os comprimentos de onda no arquivo de fundo e copie e cole os dados em um novo arquivo. Em seguida, calcule o fundo médio para cada bem e cada comprimento de onda.
Depois de copiar e colar os dados de calibração e cinética da mesma maneira, subtraia o plano de fundo de cada ponto de dados para cada comprimento de onda. Para cada ponto de tempo e cada amostra, calcule a razão entre a fluorescência sensível ao pH e a fluorescência insensível do pH. Para cada ponto de tempo, gere uma curva padrão a partir das proporções e plote os valores conhecidos de pH no eixo x e as razões no eixo y.
Determine o ponto de tempo em que as razões são estáveis, encaixe uma linha de regressão linear e obtenha a equação para esta linha. Em seguida, calcule o pH para cada ponto de tempo e plote o pH no eixo y e o tempo no eixo x. Neste experimento preliminar representativo sem células no mesmo pH e mesma concentração, as razões de emissão sensível ao pH e pH-insensíveis diferem dependendo do volume do corante.
Além disso, no mesmo pH e no mesmo volume, diferentes concentrações de corante proporcionaram valores de razão diferentes, indicando que mudanças no volume ou concentração de corante afetam o valor absoluto do pH calculado a partir da razão de emissão. Além disso, o tempo necessário para o equilíbrio da temperatura é de aproximadamente 15 a 20 minutos, independentemente do volume de corante ou concentração. Os valores de pH asl obtidos a partir de uma única curva padrão global demonstram uma diferença significativa entre culturas de fibrose não cística e fibrose cística.
Considerando que o pH asl não é significativamente diferente entre fibrose cística e células epiteliais das vias aéreas humanas não císticas quando o pH é calculado a partir de curvas padrão independentes. Portanto, é importante gerar curvas de calibração independentes para cada experimento e dentro de cada experimento, para cada amostra de doador, pois quando as curvas de calibração são mediadas em conjunto, valores de proporção mais sensíveis ao pH e insensíveis de pH são encontrados em culturas de fibrose cística indicando um pH mais ácido. Como esperado, a adição de forskolin basolateral aumenta significativamente o pH ASL apenas em culturas de fibrose não cística.
Como essas células foram mantidas sob condições estéreis, elas podem ser lavadas, re-alimentadas e usadas alguns dias depois para experimentos futuros. Todos os espécimes humanos biológicos devem ser considerados potencialmente perigosos. Portanto, certifique-se de usar o nível adequado de confinamento e equipamento de proteção individual, dependendo de suas amostras.
É importante realizar as medições de fundo e as calibrações de pH para cada conjunto de amostras, a fim de reduzir a variabilidade entre doadores e melhorar a precisão.
