Este protocolo nos permite isolar populações de fibroblastos ativados quiescentes e induzidos por lesões com pureza significativa. A principal vantagem dessa técnica é sua flexibilidade para improvisação. Para o fluxo, bem como o isolamento baseado em contas, pode-se incorporar anticorpos contra células contaminantes para excluí-las das células-alvo isoladas.
Esta técnica é usada principalmente para o isolamento do fibroblasto cardíaco. No entanto, pode ser utilizado para isolar fibroblastos de outros tecidos. Demonstrando este procedimento estarão Meiling Melzer, estagiária de graduação, e David Beier, assistente de pesquisa do meu laboratório.
Para preparar uma placa de seis poços para armazenar seis corações durante a dissecção, dispense dois mililitros de KHB frio em cada poço, e coloque a placa no gelo. Pulverize o corpo com 70% de etanol. Oriente-o para que o lado ventral esteja voltado para o experimentador.
Fixar os apêndices para evitar interferências. Sem perfurar o fígado, abra a pele abdominal e o músculo. Corte verticalmente em direção ao esterno, abrindo cuidadosamente o tórax sem perfurar o coração.
Em seguida, continue cortando a caixa torácica para expor o coração. Usando fórceps, levante suavemente o coração para fora do peito, cortando qualquer pulmão ou excesso de tecido preso ao lado externo do coração. Separe o ventrículo esquerdo.
Para cada dissecção, coloque o ventrículo em um poço separado da placa de seis poços. Primeiro, use fórceps para espremer e agitar repetidamente o ventrículo em KHB para remover o excesso de sangue. Transfira o ventrículo para uma placa limpa, estéril e quadrada de 10 centímetros quadrados.
Em seguida, usando uma lâmina de um único gume, pique rapidamente o ventrículo em pequenos pedaços. Adicione um mililitro de coquetel de digestão de colagenase, e continue picando. Quando as peças forem pequenas o suficiente para serem transferidas com uma micropipette de um mililitro, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.
Lave o prato duas vezes com dois mililitros de coquetel e transfira a lavagem para o tubo. Incubar o tubo por 30 minutos, e resususpensar as células como descrito no manuscrito usando uma pipeta de cinco mililitros. Após a ressuspensão inicial, incubar as células por 15 minutos, e resuspend novamente usando uma pipeta de 10 mililitros.
Em seguida, coloque um coador de células de 40 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros, e prime o coador, molhando-o com um a dois mililitros de KHB. Adicione 25 mililitros de KHB à suspensão de digestão e resuspend. Filtre a suspensão através do coador, substituindo o coador conforme necessário.
Centrifugar o filtrado a 400 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernasciente e resuspense a pelota em 1x RBC lysis buffer usando cinco mililitros de tampão por coração. Depois de incubar a suspensão por dois minutos em temperatura ambiente, centrifufique a suspensão a 400 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente.
Remova o supernatante e, em seguida, resuspense a pelota em um mililitro de KHB. Em seguida, adicione nove mililitros de KHB à suspensão. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Centrifugar o tubo cônico a 400 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, remova o supernasce, e resuspense a pelota em um mililitro de mídia fibroblasto ou PBS. Após a determinação do número celular, os fibroblastos podem ser isolados da suspensão por três métodos diferentes descritos no manuscrito.
Para começar o isolamento por revestimento diferencial, prepare uma placa de seis poços adicionando dois mililitros de mídia fibroblasto a cada poço. Gire a placa para cobrir as partes inferiores do poço. Se as células cardíacas do rato forem suspensas em PBS, centrífugas e resuspensas em um mililitro de mídia fibroblasto por coração.
Adicione um mililitro de suspensão celular, o equivalente a um coração, a cada poço. Gire a placa para distribuir as células uniformemente. Adicione um adicional a dois mililitros de mídia fibroblasto por poço para um volume total de até quatro mililitros por poço.
Incubar a 37 graus Celsius por quatro horas. Como os fibroblastos aderirão seletivamente aos poços, eles podem ser isolados removendo e descartando a mídia. Lave as células anexadas restantes com dois mililitros de PBS, e depois adicione dois a quatro mililitros de mídia fibroblasto estéril por poço.
Incubar a 37 graus até confluente, mudando a mídia a cada dois ou quatro dias. Para iniciar a rotulagem magnética e separação de células hematopoiéticas CD45 positivas, centrifugar uma suspensão de células cardíacas do rato a 500 vezes g por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota celular em um mililitro de tampão de equilíbrio.
Conte as células usando um hemócito. Depois de centrifugar as células novamente, resuspense a pelota celular no buffer de equilíbrio. Adicione contas magnéticas CD45 positivas e misture bem.
Incubar por pelo menos 15 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células adicionando tampão de equilíbrio e centrifugando a 500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e conte as células usando um hemótmetro.
Resuspense a pelota no buffer de equilíbrio. Passe a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros para evitar que as agregações celulares entupirem a coluna de separação. Em seguida, coloque uma coluna de separação no campo magnético de um separador adequado, e equilibre a coluna com pelo menos três mililitros de PBS.
Despeje a suspensão celular através da coluna, e colete o fluxo através, que conterá as células sem rótulo, em um tubo cônico de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de equilíbrio e misture as lavagens com o fluxo. Remova a coluna do separador e coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mililitros.
Para elutar as células cd45 positivas rotuladas, pipeta cinco mililitros de tampão de equilíbrio na coluna, e mergulhar a coluna firmemente. Centrifugar o tubo de eluent e o tubo de fluxo a 500 vezes g. Conte as células usando um hemócito.
Para completar o isolamento, siga os protocolos no manuscrito para as células endoteliais CD31 positivas e os fibroblastos MEFSK4 positivos, que são semelhantes ao protocolo para as células CD45 positivas. A triagem celular ativada pela fluorescência foi realizada em células únicas isoladas dos corações dos camundongos alfa-SMA-GFP após o infarto do miocárdio. Um esquema representativo de gating demonstra células GFP-positive co-expressando CD31, CD45 ou AN2.
Nos corações dos camundongos feridos, uma pequena porcentagem de células endoteliais e células hematopoiéticas expressavam GFP. No entanto, as células GFP-positive/CD31-negativo/CD45-negativo não expressaram AN2, um marcador de pericílito. Células GFP-positivas expressas alfa-SMA, colágeno um alfa um, periostina e vimentina.
Fibroblastos não feridos isolados pela adesão seletiva expressaram vísína, mas não demonstraram expressão de alfa-SMA, periostina ou colágeno um alfa. Ambos os fibroblastos não feridos e ativados expressaram o antígeno MEFSK4. Ambos os fibroblastos ilesos, isolados pela adesão seletiva, e myofibroblasts, isolados e classificados de camundongos alfa-SMA-GFP, demonstraram uma capacidade de contrair colágeno.
É importante picadinho o tecido completamente antes da incubação. Antes da separação baseada em contas, é importante passar a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros para evitar agregações celulares. As células purificadas por este método poderiam ser purificadas usando contas magnéticas associadas a anticorpos específicos de pericíte para garantir um alto nível de pureza.
Com a disponibilidade de novos anticorpos conjugados por contas, bem como ratos transgênicos repórteres, pode-se utilizar essas técnicas para isolar e estudar populações celulares distintas, não apenas fibroblastos.
