Neurodengração em muitas doenças neurológicas é um processo crônico do qual a perda de fibras neuronais ocorre frequentemente antes da perda do corpo celular. A quantificação esterológica das fibras neuronais em três dimensões fornece um método sensível e preciso para detectar mudanças neurodegenerativas precoces. Esta tecnologia utiliza o fracionamento imparcial confiável e eficiente baseado em computador de bolas espaciais para medir os comprimentos de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em 3D.
Demonstrar que o procedimento será feito por Prabhakar Singh, um pós-doutor e nosso especialista em estereologia, e David Peng, o assistente de pesquisa do meu laboratório. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal no camundongo anestesiado, perfuse transcardialmente com aproximadamente 50 mililitros de gelo frio 0,1 molar DPBS, seguido por aproximadamente 25 mililitros de 4% PFA em PBS molar. No final da perfusão, pós-fixar o cérebro em um recipiente de 4%pfa fresco por 24 horas a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, lave o cérebro com três lavagens de um a dois minutos em DPBS frescos por lavagem e transfira o cérebro para uma sacarose de 15% em solução de 0,1 DPBS durante a noite. Na manhã seguinte, coloque o cérebro em uma solução de 30% de sacarose e 0,1 DPBS molar por 48 horas a quatro graus Celsius. No final da incubação, transfira o cérebro para uma câmara criotome pré-definida para menos 20 graus Celsius.
Cérebros podem ser mantidos em tubos selados e armazenados a menos 80 graus Celsius. Para secção, incorpore a amostra de tecido no meio de incorporação da temperatura de corte ideal e monte a amostra em um disco de amostra. Em seguida, adquira seções de espessura de 30 micrômetros em um plano coronal no criotome, transferindo cada seção para poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços contendo solução crioprotetora em preparação para armazenamento de menos 20 graus Celsius.
Para identificar a primeira e última seção de cada cérebro, compare as características morfológicas com um atlas cerebral padrão do rato. O NBM começa em bregma menos 0,0 milímetros e termina em menos 1,6 milímetros. A seleção de cada oitava seção rende um total de seis a sete seções e permite um coeficiente apropriado de erro tanto para uma estimativa de comprimento de volume e fibra.
Para rotulagem imunohistoquímica das seções teciduais, depois de bloquear qualquer ligação inespecífica com soro bovino 10% normal em 0,1%Triton X-100 em soro tampão tris, rotule as seções com o anticorpo primário de interesse por 48 horas a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as seções três vezes por três minutos em soro fisiológico fresco com tampo tris por lavagem, seguido de incubação com um anticorpo secundário biotinilado apropriado por uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as seções três vezes em salina tamponada com Tris fresco, como demonstrado, seguida de coloração com complexo de peroxidase de biotina avidin e solução de substrato de peroxidase DAB de acordo com os protocolos do fabricante.
Após a lavagem, monte todas as seções de uma amostra de tecido cerebral em um slide gelatinizado e permita que as amostras sequem. Para desidratar as seções, mergulhe as amostras duas vezes por cinco minutos por diluição em soluções sequenciais de etanol ascendente, como indicado, seguido de compensação com duas lavagens de xileno de 10 minutos. Em seguida, use um meio de montagem apropriado para colocar tampas nos slides.
Para estereologia, abra um novo estudo no software. Uma caixa de diálogo de inicialização do estudo será aberta. Preencha as informações do estudo e confirme que a fração de vários níveis está selecionada.
Clique duas vezes no volume para abrir a caixa de diálogo de volume. Nomeie o recurso de interesse e selecione o teste de contagem de pontos da região e clique em seguida. Clique duas vezes no comprimento e forneça um nome do recurso.
Selecione o teste de esfera e clique em seguida. Na caixa de inicialização do caso, para codificar os grupos antes de iniciar o estudo, defina o número total de seções a partir da primeira seção contendo a área de interesse até a última seção contendo a área de interesse e o intervalo de amostragem da seção para oito. Clique ao lado para abrir a caixa de diálogo de inicialização do teste que definirá automaticamente a menor ampliação para a seleção da região e estimativa de volume e confirme as configurações.
Clique na pré-visualização para verificar se a região de interesse pode ser identificada na ampliação inferior selecionada. Digite 50.000 micrômetros cubo por ponto para a fração de volume da região e clique em visualização e feito. Sob a alta ampliação do objeto, defina o comprimento para 63X e o comprimento de dois cliques para abrir a caixa de diálogo da esfera de comprimento.
Defina o diâmetro desta esfera para 10 micrômetros e clique feito. Defina valores apropriados para a área do quadro, altura do quadro, zona de guarda e espaçamento da estrutura. Em seguida, clique em seguir e siga as instruções fornecidas pelo software.
Para inserir a primeira seção, coloque o slide no estágio do microscópio sob um objetivo de 5X e clique na seta verde para desenhar um limite arbitrário ao redor do NBM para definir a região de interesse. Clique na seta verde e feito para alterar o objetivo 63X para obter as medidas de fibra da fração atual. A caixa de diálogo de espessura da seção aparecerá.
Defina a superfície superior e inferior da seção para medir a espessura real da seção usando o botão de foco manual do eixo z e clique feito. Mova o eixo z lentamente de cima para baixo na altura da estrutura da seção para marcar todas as fibras interseccionais na superfície da sonda de esfera virtual. Quando todas as fibras tiverem sido marcadas, clique ao lado para avançar para o próximo local.
Quando todas as frações tiverem sido concluídas, clique no arqueiro verde. O software pedirá para inserir a próxima seção. Leve a próxima amostra no slide para o foco usando o objetivo 5X e repita a medição da fibra como apenas demonstrado.
Quando todas as seções tiverem sido medidas, o software gerará um resultado para o caso mostrando o coeficiente de valores de erro. Se o coeficiente de erro for aceitável, proceda para o próximo caso. Se o coeficiente de erro não for aceitável, o software fornecerá recomendações para alterar alguns dos parâmetros.
Quando todos os casos forem concluídos, gere resultados para cada caso e grupo. Neste experimento representativo, o grupo de proteína precursora beta amiloide mutante sueco demonstrou um comprimento de fibra significativamente menor e densidade de comprimento de fibra em comparação com seus companheiros de lixo do tipo selvagem. Os resultados também mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM entre os dois grupos analisados.
Esta técnica requer a aquisição adequada na orientação correta e um bom método de coloração com o período de incubação. O protocolo de estereologia pode ser usado para a estimativa de quaisquer perfis lineares, como outras fibras neuronais, processos de astrócito ou mesmo perfis vasculares.
