Este prático pode nos ajudar a estudar mudanças dinâmicas dos componentes nanoestrusivos do maquinário mecânico de transdução elétrica na superfície dos feixes de esterecilia da célula ciliar. A principal vantagem dessa técnica é a imagem de lapso de tempo da superfície das células vivas com topografia complexa em resolução de nanômetros simples, e sem fazer contato físico com a amostra. Esta técnica pode ser aplicada a quase qualquer célula viva.
Anteriormente, combinamos com a superfície das linhas de células epiteliais pulmonares infectadas com vírus, células musculares, em My Image Bacteria Soon. Teste os nanopipettos no início de cada sessão de imagem. Depois de fabricar uma nanopipette, verifique se há bolhas, remova quaisquer bolhas se presentes e monte a nanopipette no suporte de pipeta de microscópio de condução da sonda de salto.
Em quatro mililitros de solução de banho para a câmara e coloque a câmara no palco HPICM. Introduza o eletrodo moído à solução de banho e certifique-se de que a tensão que está sendo aplicada na pipeta através do amplificador de grampo de remendo é zero. Depois de colocar o micro manipulador na posição vertical, mova a pipeta em Z até que toque o líquido e ajuste o amplificador para zero, antes de adicionar mais 100 milvolts para verificar a corrente da pipeta.
Use cola de silicone para anexar o padrão de calibração AFM à câmara e cubra a amostra com quatro mililitros de HBSS. Use fita dupla face para fixar a câmara ao estágio X Y da configuração HPICM e carregue uma nova nanopipette no suporte, conforme demonstrado. Depois de testar a resistência e o diâmetro da nanopipette, defina a corrente para um nano amp.
Use um manipulador de grampos grosseiro para posicionar a nanopipette aproximadamente acima do centro do padrão de calibração e aumentar o ponto de ajuste enquanto monitora o sinal do sensor do atuador Z piezo em um osciloscópio em tempo real. Após estabelecer um ciclo de aproximação Z repetitivo estável, diminua o ponto de conjunto para o valor logo acima do ponto de instabilidade e mova a pipeta para baixo a uma velocidade de aproximadamente cinco mícrons por segundo, até chegar à amostra. O nível inferior do sinal de posicionamento Z em tempo real aumentará, indicando que a nanopipette é retirada devido à detecção da superfície da amostra.
Devido à montagem desigual no padrão AFM, o ponto mais alto da área de interesse pode ser desconhecido. Por isso, coloque a amplitude da retração da pipeta em pelo menos 200 a 500 nanômetros. Tomando cuidado para não exceder o limite superior do movimento atuador Z piezo, comece a imagem em baixa resolução.
Uma vez identificado o ponto mais alto da amostra na área de imagem, diminua a amplitude do lúpulo e retraia a pipeta cerca de 200 mícrons ao longo do eixo Z para evitar qualquer colisão indesejada com a amostra antes de movê-la para um novo local X Y. Quando a área de interesse estiver localizada, comece a fotografar em uma resolução mais elevada. Para imagens auditivas de células ciliares, proteja firmemente um órgão recém-isolado de Corti a uma câmara usando fio dental ou pipetas de vidro flexíveis.
Use fita dupla face para fixar firmemente a câmara no estágio X Y piezo e carregar uma nova nanopipette no suporte, como demonstrado. Depois de verificar a resistência à nanopipette, use o micro manipulador de grampos para posicionar a nanopipette sobre a região da célula ciliada enquanto observa o órgão da planta Corti X em um microscópio invertido. Registre, o sinal de posicionamento atual e Z em tempo real no osciloscópio para verificar se o sistema está estável com um ponto de ajuste de 0,5%6 ou mais baixo, e determinar o ponto de ajuste ideal e aproximar-se da amostra como demonstrado.
Realize imagens de baixa resolução da amostra como demonstrado usando uma amplitude de lúpulo de pelo menos seis a oito mícrons. Se a nanopipette precisar se mover para um novo local X Y, retraia a pipeta cerca de 500 nanômetros para evitar uma colisão com quaisquer características altas dentro do tecido e repetir a baixa resolução de imagem HPICM até a região de interesse onde as células ciliadas estão localizadas. Em seguida, imagem a região de interesse em uma resolução maior em 15 minutos ou menos.
O protocolo HPICM pode ser usado para visualizar quaisquer células vivas com uma topografia complexa, como pacotes de células ciliros auditivas ao vivo. Apesar de demonstrar uma resolução X Y mais baixa em comparação com imagens de microscopia eletrônica, as imagens HPICM podem resolver com sucesso as diferentes linhas de estereócilia. A forma das pontas estereócilias e até mesmo as pequenas ligações de cinco nanômetros que conectam os estereócilias adjacentes.
Dada a natureza não-contato da imagem HPICM, a imagem contínua de lapso de tempo do mesmo feixe de células ciliares pode ser realizada por várias horas sem danificar a coesão do feixe. Note que com um set point muito baixo, o sistema pode interpretar pequenas flutuações na corrente como encontrar a superfície celular, levando ao ruído de ponto branco na imagem. Da mesma forma, grandes amplitudes de lúpulo podem aumentar a ressonância lateral da pipeta, resultando também na produção de pixels barulhentos.
Em contraste, se a amplitude do lúpulo for muito pequena, ou o setpoint for muito alto, a nanopipette pode colidir com a amostra resultando em artefatos de imagem ou danos no feixe de cabelo. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é gastar menos de 15 minutos por feixe de células ciliar ao trabalhar com células vivas. Depois de obter uma imagem do feixe de cabelo, pode-se tentar obter gravações de canal único de locais específicos na superfície da estereócilia para responder perguntas sobre propriedades do canal de mecanotransdução.
