Neutrófilos são células terminais diferenciadas, e atualmente não há linhas celulares para recapitular totalmente a biologia neutrófila. Assim, é necessário obter neutrófilos puros, inativados, saudáveis e frescos para estudar sua biologia. Este método de atualização combina gradiente de densidade, sedimentação, lise suave para obter uma preparação neutrófila pura.
É fácil de configurar, requer equipamentos simples e pouca prática. O aspecto técnico, como a camada de gradiente, deste método exigirá alguma prática para dominar, mas uma vez que o gradiente é aperfeiçoado os outros passos devem vir como uma brisa. Comece esterilizando o casaco, a embalagem e o capô laminar.
Em seguida, adicione 10 mililitros do sangue em um tubo de 50 mililitros. Para diluir o sangue para um limpador de gradiente, adicione 5% FBS/HBSS e reúbe o volume até 35 mililitros. Depois de fechar a tampa, inverta o tubo várias vezes para misturar e, em seguida, mantenha o tubo de cabeça para baixo para obter o fundo desprovido de glóbulos vermelhos.
Adicione 10 mililitros do meio gradiente de densidade diretamente abaixo do sangue, garantindo que o meio e o sangue não se misturem e a interface permaneça afiada. Gire o tubo a 400 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente, certificando-se de desativar o freio. Após girar, observe o gradiente separado em uma camada superior de plasma sérico, um anel branco médio de células mononucleares de sangue periféricos, uma camada média de gradiente de densidade nebulosa, e uma pelota inferior consistindo de uma faixa branca e fina de neutrófilo em cima dos glóbulos vermelhos.
Para remover o PBMC, emerja a pipeta de sucção diretamente na camada PBMC e aspire completamente enquanto a camada de plasma de soro está sendo diminuída à medida que o anel é removido. Raspe a lateral do tubo com a pipeta de sucção para maximizar a remoção do PBMC. Remova cuidadosamente a camada média de gradiente de densidade nublada entre o anel PBMC e a pelota de neutrófilo/RBC.
Para sedimentação eritrócito, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a pelota de neutrófilo/RBC em um tubo limpo. Em seguida, adicione 5%FBS/HBSS a um volume final de 25 mililitros. Adicione diretamente 25 mililitros da solução pré-armada contendo 3%dextran/0,9% NaCl na água no tubo e misture suavemente por inversão.
Coloque o tubo em uma superfície nivelada e não vibrante por 15 minutos. Depois de colocar o tubo de volta no capô, mergulhe ligeiramente a pipeta no líquido e colete aproximadamente 30 mililitros da camada superior seguindo a superfície líquida para baixo. Gire o tubo para obter uma pelota vermelha sem partículas flutuantes na mídia.
Para a lise do RBC residual, aspire suavemente o supernante sem interromper a pelota. Adicione 25 milímetros de água ultrauso estéril diretamente no tubo e misture suavemente invertendo o tubo por 28 segundos para lise o RBC. Em seguida, adicione imediatamente 25 mililitros de solução estéril de 1,8% NaCl preparada em água para o tubo e traga a solução de volta às condições isotônicas por mistura suave.
Gire o tubo a 200 vezes g por três a cinco minutos com um freio baixo para minimizar a sedimentação de RBC e plaquetas com neutrófilos. Para reaprirentar a pelota de neutrófilo branco, adicione diretamente o meio de cultura na pelota, mas não encobrindo para cima e para baixo. Em seguida, balance o tubo horizontalmente de um lado para o outro para minimizar a ativação celular.
Se for observada agregação celular ou agrupamento, filtre a suspensão celular através de uma malha de 70 micrômetros para descartar os neutrófilos desajeitados. Para avaliar a qualidade da preparação isolada de neutrófilos, colori as células com marcadores específicos para neutrófilos, eosinófilos e um marcador de ativação. Após adquirir 20.000 células por citometria de fluxo, analise a pureza e ativação celular utilizando as estratégias de gating e determine a viabilidade celular usando iodecida de anexo V/propidium, conforme descrito no manuscrito do texto.
O gradiente de densidade com baixa velocidade rendeu neutrófilos com mais pureza, enquanto uma alta velocidade resultou em aumento do rendimento em detrimento da pureza. Usando a triagem celular ativada pela fluorescência, a distribuição celular por si só forneceu uma estimativa da qualidade de isolamento celular, mas o uso de marcadores celulares específicos deve ser preferido. As populações celulares contaminantes identificadas foram monócitos, linfócitos e eosinófilos.
O enorme rendimento de neutrófilo foi alcançado usando este protocolo. Foi avaliada a expressão do CD62L. A intensidade fluorescente média para CD62L foi diminuída nas células de controle positiva, indicando derramamento de CD62L e ativação de neutrófilos.
A saúde do neutrófilo deve ser avaliada antes de realizar o ensaio, pois os neutrófilos têm uma meia-vida relativamente curta e a ativação encurta ainda mais a vida útil. Após a purificação de neutrófilos usando o gradiente de densidade e microesferas comerciais, as células foram cultivadas por 24 horas e a sobrevivência celular foi analisada por citometria de fluxo. A quantificação de células viáveis indicou que a purificação do gradiente de densidade resultou em células mais viáveis após 24 horas do que a purificação usando um kit.
É importante que as etapas de camadas gradientes e centrífugas sejam realizadas da melhor forma possível, pois impactarão muito a qualidade da preparação. Experimentos in vitro e ensaios bioquímicos podem ser realizados após este procedimento. Além disso, a seleção negativa poderia ser realizada se as células ultrapuras forem necessárias como em experimentos de citocina e expressão proteica.
