Este método permite a visualização do cérebro de Zebrafish em estágios larvais posteriores para permitir a observação da arquitetura neuronal de forma altamente detalhada in vivo que antes não era possível. As células pigmentas, que surgiram durante o desenvolvimento larval posterior e impedem o cérebro de imagens claras, não são problema com este método porque são simplesmente removidas. Com o método, deve ser possível estudar processos que ocorrem em estágios posteriores durante o desenvolvimento larval do cérebro, processos que impactam na plasticidade sináptica, degeneração dos neurônios ou sua regeneração.
Antes de começar o experimento use um puxador de micropipette para preparar agulhas de vidro afiadas, finas e de vidro de capilares de vidro. Em seguida, use uma pipeta pasteur de plástico para coletar larva em uma placa Petri de 90 milímetros de diâmetro contendo a solução apropriada. Transfira a larva selecionada para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro contendo ACSF e coloque uma tampa de vidro de 24 por 24 milímetros na tampa da placa de Petri.
Em seguida, aliquotar o volume de ACSF necessário para o experimento em um phial apropriado para oxigenação com carbogen. Para incorporar a larva, use uma pipeta Pasteur para transferir a larva anestesiada para uma câmara de montagem sob um estereoscópio. Se alguma larva ainda for capaz de se mover, não use o peixe para o experimento até que os peixes sejam completamente incapazes de se mover.
Quando a larva estiver imóvel, remova cuidadosamente o excesso médio e adicione imediatamente pelo menos um mililitro de baixa fusão à larva. Oriente o zebrafish com a região dorsal o mais próximo possível da superfície da ágarose. Se a larva for imagem usando um microscópio invertido, após uma solidificação, corte a agarose contendo a larva em um pequeno bloco cuboide.
Para expor o cérebro para a imagem, corte o excesso de agarose sobre a região do cérebro de interesse conforme necessário e use uma agulha de vidro para fazer uma pequena incisão através da pele perto, mas não mais, a região de interesse sem penetrar muito profundamente no tecido. Mal movendo a agulha logo abaixo da superfície da pele, continue fazendo cortes muito pequenos ao redor da região de interesse até que a pele sobre a região de interesse possa ser removida ou deixada de lado. Quando o tecido tiver sido removido de todos os embriões, adicione uma pequena gota de baixa derretimento agarose à câmara de imagem previamente preparada de um microscópio invertido e use uma pequena espátula para virar o bloco de ágarose cuboide 180 graus sobre a gota de agarose na câmara de imagem.
Quando a agarose se solidificar, encha a câmara de imagem com ACSF fresco e comece a fotografar a larva. Aqui, uma larva transgênica pós-fertilização intacta de 14 dias com o crânio ainda intacto pode ser observada. Como mostrado, as células pigmentadas dentro da pele sobreposta são distribuídas por toda a cabeça, interferindo com o sinal fluorescente na região de interesse.
Após cirurgia aberta no crânio, a área de interesse torna-se livremente acessível para imagens detalhadas de alta resolução. A barreira cerebral de pele, crânio e ou sangue também dificultam a penetração de substâncias no cérebro, como ilustrado pela robusta coloração de corante nuclear observada nessas células cerebrais somente após a cirurgia aberta do crânio. Essas vantagens também são observadas em 30 dias após a fertilização.
Em peixes transgênicos contendo uma vasculatura cerebral fluorescente devido à expressão da proteína fluorescente vermelha, mCherry, em células endoteliais, a codificação de cores nos valores de profundidade da pilha de imagens demonstra que mesmo os vasos sanguíneos profundamente enterrados dentro do cérebro para quase 250 mícrons ainda são claramente visíveis e rastreáveis. Ao realizar este procedimento sempre tenha em mente que esta é uma cirurgia em um animal vivo. Portanto, requer respeito e uma mente focada.
Após esse procedimento, o registro da morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas, eventos fisiológicos e de transporte intracelular podem ser realizados em larvas com mais de sete dias após a fertilização. Com essa técnica, esperamos fornecer uma abordagem que permita estudar também processos celulares no cérebro que ocorrem em estágios larvais posteriores, e que estejam envolvidos no estabelecimento, por exemplo, de comportamentos complexos como comportamento social ou tomada de decisão.
