Este protocolo descreve como aplicar uma metodologia pretargeted à radioterapia direcionada de xenógrafos de câncer no modelo do camundongo. A radioimunoterapia pretargeted ou PRIT nos permite injetar o anticorpo e radioligand separadamente, e deixar os dois combinarem in vivo usando química de clique. Enquanto apresentamos PRIT usando um modelo de xenógrafo de câncer colorretal, esta técnica pode ser aplicada a qualquer anticorpo de alvo de antígeno superficial.
É importante selecionar um antígeno que não internalize rapidamente ou desadeudo extensivamente, pois estes podem reduzir a eficácia da abordagem. Para sintetizar huA33-TCO, prepare pela primeira vez uma solução de 125 microliter de 40 mililígenos por mililitro TCO-NHS em metilaformamida seca em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Esta solução pode ser alitada e congelada a 80 graus celsius para uso em experimentos futuros.
Em um tubo de microcentrifuge separado de 1,7 mililitro prepara uma solução de cinco miligramas por mililitro de huA33 em um mililitro de salina tamponada de fosfato. Utilizando pequenas alíquotas de carbonato de sódio molar de 0,1, ajuste o pH da solução de anticorpos para entre 8,8 e 9,0. Use papel pH ou um medidor de pH com um microeletrodo para monitorar o pH, e tenha cuidado para que o pH não exceda 9,0.
Adicione um volume correspondente a 40 equivalência molar de TCO-NHS à solução de anticorpos. Para evitar a precipitação do TCO-NHS hidrofóbico, adicione-o lentamente e com agitação. Deixe a reação incubar a 25 graus celsius em uma batedeira térmica por uma hora com leve agitação.
Antes de purificar o imunoconjugado huA33-TCO usando uma coluna de exclusão de tamanho descartável pré-embalada, equilibre a coluna de exclusão de tamanho descrita pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento que geralmente envolve lavar a coluna cinco vezes com um volume de PBS que corresponde ao volume da coluna. Adicione a mistura de reação à coluna de exclusão de tamanho, observando o volume da mistura de reação. Depois que a mistura de reação entrar, a coluna adiciona uma quantidade apropriada de PBS para trazer o volume total de solução adicionado à coluna até 2,5 mililitros.
Colete o produto usando dois mililitros de PBS como eluente. Meça a concentração do huA33-TCO usando um espectotómetro UV vis monitorando o comprimento de onda em 280 nanômetros. Se uma solução com maior concentração de imunoconjugado for desejada concentre a solução huA33-TCO usando uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de 50.000 seguindo as instruções do fabricante.
Armazene o imunoconjugado huA33-TCO completo a 4 graus celsius no escuro. Se for para ser usado mais de quatro dias no futuro armazene-o a 80 graus celsius no escuro. Em um tubo de centrífugas de 1,7 mililitros adicione 200 microliters de 0,25 tampão de acetato de amônio molar ajustado para pH 5.5.
Adicione a quantidade desejada de cloreto de Lutetium-177 à solução tampão. A quantidade adicionada dependerá do número de indivíduos no experimento e das doses radioativas que estão sendo administradas. Adicione Tetrazine PEG7-DOTA em DMSO à mistura radioativa.
O valor adicionado depende do número de indivíduos que estão sendo testados. Deixe a solução incubar a 37 graus celsius por 20 minutos. Verifique se a rotulagem de rádio está completa usando cromatografia de camada fina radio-instantânea com 50 milimões EDTA pH 5.5 como fase móvel.
O Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine permanecerá na linha de base, enquanto o Lutetium-177 livre será coordenado pelo EDTA e viajará com a frente solvente. É fundamental que a colocação dos tumores subcutâneos não interfira na sua técnica de contenção. Recomendo colocá-los no lado flanco que é oposto à sua mão de contenção.
Desde que me contenha com a mão esquerda, escolhi colocar os tumores no flanco direito. Classificar camundongos nus atrímicos femininos com xenógrafo de câncer colorretal, de modo que o volume médio de tumor em cada coorte é aproximadamente igual. Para isso, liste os números de identificação animal, padrão de entalhe de ouvido e volume de tumor em três colunas separadas de um programa de planilha.
Classifique os dados do menor ao maior volume de tumores. Em uma quarta coluna atribuir a cada animal um número de gaiola. Pedale pelas gaiolas em um padrão parecido com uma cobra até que todos os animais sejam designados para uma gaiola.
Uma vez que as gaiolas são atribuídas classificam os dados por número de gaiola. Para injetar as doses de imunoconjugados de 150 microliters de solução huA33-TCO em seringas pré-tratadas com albumina de soro bovino de 1% na PBS, e armazenar essas seringas no gelo. Para injetar o radioligand, primeiro desenhe doses em 150 microliters de soro fisiológico 0,9% estéril contendo 1,1 equivalência molar da Tetrazine-PEG7-DOTA radiolabeled em relação à quantidade de huA33-TCO administrado.
Use pinças para medir o lado mais longo do tumor oblongo, bem como a largura que é perpendicular ao comprimento. Pesar cada rato em um equilíbrio para acompanhar o ganho de peso ou a perda de peso ao longo do tempo. Finalmente, calcule o volume usando a fórmula para o volume de um elipsoide assumindo que a altura é aproximadamente igual à largura.
Mostrado aqui é a biodistribução de um in vivo pretargeting com huA33-TCO e Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine em camundongos nude atrímicos com tumores de caner colorretal humano s.1222 humanos. Todos os intervalos de injeção produzem altas concentrações de atividade no tecido tumoral, bem como baixas concentrações de atividade em órgãos saudáveis. O intervalo de injeção de 24 horas proporciona a maior absorção tumoral em 120 horas após a injeção.
Com base nesses achados, foi escolhido um intervalo de 24 horas para o estudo subsequente de terapia longitudinal. Aqui é mostrado o estudo de terapia longitudinal de cinco grupos de camundongos com tumores SW1222 subcutâneos retratados no volume médio do tumor em função do tempo, e o volume do tumor normalizado para o volume inicial em função do tempo. Há uma grande diferença na resposta das coortes experimentais em comparação com os grupos de controle.
Enquanto os tumores nos camundongos que receberam apenas um componente da estratégia de radioimunoterapia pretargeted continuaram a crescer sem controle, os tumores dos camundongos que receberam o regime completo de radioimunoterapia pretargeted pararam de crescer e, finalmente, encolheram. É importante ressaltar que não foram observados efeitos colaterais tóxicos, e todos os animais mantiveram um peso dentro de 20% de sua massa inicial. Surpreendentemente, os ratos das coortes experimentais tinham um registro perfeito de sobrevivência no final da investigação.
Ao tentar este procedimento é de extrema importância medir com precisão e reprodutivelmente os tumores. Ao trabalhar com radioatividade consulte o oficial de segurança de radiação da sua instituição para desenvolver protocolos e instalações seguras. Ter controles de segurança adequados no local limitará sua exposição e evitará contaminação.
Pretargeting oferece uma dose de radiação menor para órgãos de fundo do que a radioimunoterapia tradicional. Ao compartilhar este protocolo, esperamos que outros possam testar seus próprios modelos e ideias que levarão a novos e emocionantes avanços para o tratamento do paciente.
