O método de corte de precisão das fatias pulmonares preservará a estrutura e as orientações espaciais em três dimensões sem viés regional e poderá servir como um modelo de substituto vivo para as medidas de contração de vasos e vias aéreas. Em combinação com imagens de lapso de tempo, bolha ocidental e análise de RNA, as fatias pulmonares cortadas com precisão contribuem para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma grande variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares. Para começar, coloque o rato adulto eutanizado em uma posição supina e fixe-o no lugar, gravando as patas e o nariz na mesa com fita adesiva.
Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol. Use fórceps para levantar a pele abdominal do camundongo na localização da bexiga e tesoura cirúrgica para cortar na linha média, movendo-se superiormente para a região cervical para expor a traqueia. Em seguida, use pinças para levantar a camada de fáscia subjacente e usar tesoura cirúrgica para expor os órgãos viscerais e compartimento mediastinal, novamente cortando inferiormente para superior.
Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão. Disseca o diafragma cuidadosamente do fígado e do compartimento abdominal. Localize a veia cava inferior sob os intestinos e corte-a.
Depois de localizar o ventrículo direito, use uma agulha borboleta de 25 a 30 para injetar 0,5 mililitros de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito e lavá-lo lentamente, mas de forma constante, com 10 a 15 milímetros de PBS. Depois de localizar a laringe, use pinças de ponta sem corte para dissecar a fáscia e tecido circundante, em seguida, coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre livremente um nó cirúrgico. Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e cannulate com uma agulha de ponta sem corte de 20 bitolas.
Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico. Em seguida, injete de 2,5 a 4 mililitros de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão. Após a injeção de agarose, despeje pbs frio sobre o pulmão para solidificar a agarose.
Em seguida, corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia. Após a solidificação, coloque o tecido em DMEM em uma placa de Petri no gelo, e imediatamente prossiga para cortar um lobo usando uma máquina de vibratome. Para preparar as fatias pulmonares, conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial voltado para cima.
Em seguida, encha o recipiente de amostra com PBS. Encha o recipiente com gelo para manter o PBS circundante e prove frio. Ligue o vibratome.
Ajuste a espessura para 300 micrômetros, frequência de 100 Hertz, amplitude para 0,6 milímetros e velocidade para cinco micrômetros por segundo. Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina. Em seguida, aperte as mandíbulas com uma chave allen.
Coloque a amostra sobre a caixa, garantindo que ela esteja submersa em PBS. Deslize a caixa para cima na posição correta e certifique-se de que está segura. Gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.
Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra. Confirme as configurações e execute o vibratome. Depois que as fatias frescas forem cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mililitros de DMEM contendo antibiótico antimíctico único.
Depois de colocar todas as fatias em uma placa de Petri, retraia a lâmina inteiramente e use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura. Armazene as amostras em DMEM a 37 graus Celsius. E coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.
Use uma limpeza para remover o excesso de meio. Coloque a amostra na microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10 a 20X para identificar um vaso. Em seguida, adicione 500 microliters de vasoconstritores, como 60 milimolars de cloreto de potássio ou uma endotelina micromolar-1 para submergir completamente o slide.
Observe e capture o vídeo gravando por 30 a 60 segundos. Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com um litro de nitrogênio líquido e coloque dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro no recipiente com nitrogênio líquido. Coloque de quatro a cinco fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.
Despeje de 5 a 10 mililitros de nitrogênio líquido em cima das fatias e use rapidamente o pilão para moer as fatias em pó antes que o nitrogênio líquido evapora. Use um scooper de laboratório de aço pré-refrigerado para colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados e lise o pó adicionando 500 microliters de reagente de extração de RNA para isolamento de RNA ou 500 microliters de tampão RIPA para lise proteica. No experimento de viabilidade representativa, a mudança de cor das fatias do PCLS foi detectada do dia zero ao um e do dia 9 a 10.
A solução foi inicialmente azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorreu dentro de uma a quatro horas, mas um tempo maior pode ser necessário. A diferença diária entre a absorvância em 562 e 613 comprimentos de onda nanômetros para o tecido preparado por vibratome é mostrada aqui.
A constrição da vasculatura em um tecido pulmonar preparado por vibratome usando endotelina-1 e cloreto de potássio pode ser visualizada aqui. A preservação da rotulagem tdTomato nas células uma semana após a injeção de tamoxifeno é demonstrada nessas fatias pulmonares. É mais importante realizar a limpeza pulmonar e a inflação passo bem para remover todo o sangue de circulação antes de experimentos adicionais e imagens.
Além das doenças vasculares, o PCLS pode ser aplicado para estudar fisiobiologia de doenças relacionadas às vias aéreas, podendo ser testado em tecidos pulmonares humanos em cenários clinicamente relevantes.
