Este protocolo permite o uso repetível de matriz extracelular pulmonar intacta como um substrato de cultura tecidual tridimensional e rendimento moderado. A principal vantagem do sistema de tecido pulmonar projetado é a flexibilidade da plataforma. Os ELTs podem ser adaptados para usar vários andaimes de tecido, células ou meios de cultura de interesse.
Uma vez extraídos os pulmões, encha uma seringa de 10 mililitros com agarose e HBSS sem vermelho fenol. Infle os pulmões com aproximadamente 10 mililitros de ar através da cânula traqueia, e injete imediatamente a agarose preparada através da cânula traqueia até que as pontas mais disstais dos lóbulos pulmonares sejam infladas. Tampe a traqueia anexando a tampa branca de uma torneira de quatro vias à trava luer fêmea da cânula traqueal.
Coloque o pulmão em uma placa de Petri de 150 milímetros no gelo para permitir que a agarose se solidifique. Prepare as fatias pulmonares de acordo com o protocolo no manuscrito, e depois encha uma placa de Petri de 100 milímetros com 1/3 de volume de PBS. Transfira e guias para o prato usando fórceps.
Se as fatias estiverem congeladas, descongele um prato de cada vez derramando em temperatura ambiente PBS. Em seguida, transfira uma fatia descongelada para uma placa de Petri de 150 milímetros. Desdobre suavemente a fatia usando fórceps finos ou um hemostat e aspira cuidadosamente o excesso de PBS ao redor do tecido.
Em seguida, corte uma tira de três milímetros de largura, pelo menos nove milímetros de comprimento da fatia, pressionando todo o comprimento de uma lâmina de barbear firmemente contra o prato e balançando-o ligeiramente de um lado para o outro. Para prender a tira de tecido na fita, flutue-a acima do, centralizando-o cuidadosamente para estender os orifícios nos clipes em cada extremidade. Coloque uma guia parcialmente no orifício em uma extremidade com fórceps finos, endireitar suavemente o tecido e coloque a segunda guia.
Por fim, use fórceps para pressionar cada guia completamente para fixar o tecido. Depois de cortar todos os lados, transfira o prato de 100 milímetros contendo as fitas para um capô de fluxo laminar. Transfira para placas de seis poços contendo a primeira solução de descelularização usando um hemostat curvo para agarrar os lados entalhados.
Em seguida, coloque a placa de seis poços em um agitador orbital a 30 RPM por 10 minutos. Aspire o fluido de cada poço, em seguida, substitua-o por três mililitros da segunda solução de descelularização por bem. Coloque a placa em um agitador orbital a 30 RPM e incubar por cinco minutos.
Repita esse processo com cada solução conforme descrito no protocolo de descelularização no manuscrito. Após a lavagem final com PBS, transfira tecidos para placas estéreis de seis poços contendo PBS fresco com antibióticos e antimípticos e incubar a 37 graus Celsius por 48 horas. Após a esterilização com antibióticos e antimícticos, os andaimes de tecido pulmonar podem ser semeados imediatamente ou armazenados a quatro graus Celsius por até 30 dias.
Antes de utilizar para a cultura, incubar andaimes armazenados a quatro graus Celsius com PBS frescos e antibióticos e antimícticos durante a noite a 37 graus Celsius como uma etapa adicional de esterilização. Em seguida, enxágue andaimes com PBS estéril, cinco mililitros por poço, três vezes, por cinco minutos cada. Examine andaimes sob um microscópio de contraste de fase na ampliação de 5X para selecionar tecidos para semeadura.
Prepare a suspensão celular endotelial em meio endotelial a 5 milhões de células por mililitro com células suficientes para semear 500.000 células endoteliais por fatia. Coloque banhos de semeadura autoclaved em pratos petri de 100 milímetros e transfira cuidadosamente os andaimes de enxágue de cabeça para baixo para os banhos de semeadura. Gire suavemente a suspensão da célula preparada para misturar.
Em seguida, cuidadosamente pipeta 100 microliters de células diretamente em cima de cada tecido na base dos poços, tomando cuidado para não danificar o tecido com a ponta pipeta. Transfira os tecidos semeados para a incubadora de cultura celular. 24 horas após a semeadura da célula endotelial, adicione 900 microliters de meio de cultura pré-aquecido a cada poço usando uma pipeta manual e, em seguida, devolva a placa à incubadora.
Após 24 horas de semeadura celular, remova o meio e substitua o mililitro de meio endotelial fresco por poço. 72 horas após a semeadura das células endoteliais, conte AEC2s, ou células epiteliais alveolares tipo II, e fibroblastos usando um hemocitômetro e preparem uma suspensão celular 1:1 em média de crescimento AEC2 a 5 milhões de células por mililitro. Pipeta o meio de cada banho de semeadura bem e gire suavemente a suspensão celular preparada.
Pipeta 100 microliters de células diretamente em cima de cada tecido na base do poço. Transfira os tecidos semeados para a incubadora de cultura celular. Após duas horas, adicione 900 microliters de meio de crescimento AEC2 pré-aquecido para cada poço e, em seguida, devolva a placa à incubadora.
Após 24 horas de cultura com AEC2s e fibroblastos, prepare uma placa de 12 poços com um mililitro de meio de crescimento AEC2 pré-aquecido por poço, por. Pipeta 800 microliters de meio de cada poço do banho de semeadura, em seguida, remova as fitas do banho de semeadura e transfira-as para o lado direito até a placa preparada de 12 poços, um por poço. Mude o meio de cultura cuidadosamente usando uma pipeta pasteur de vidro a cada dois dias para a duração da cultura desejada.
Monitore o grau de repopulação tecidual através de microscopia de contraste de fase na ampliação de 5X durante toda a duração da cultura. A coloração de H e E dos andaimes teciduais mostrou arquitetura alveolar preservada após a descelularização sem núcleos celulares visíveis. O tecido alveolar foi observado quando os andaimes de matriz extracelulares descelularizados foram vistos na ampliação de 5X por microscopia de contraste de fase.
Grandes vias aéreas e embarcações também foram visíveis em algumas fatias. No sétimo dia de cultura, a microscopia de contraste de fase mostrou que o padrão de recelularização em tecidos pulmonares projetados emulava a estrutura alveolar dos tecidos em casos de repopulação bem sucedida. A má recelularização também era visível.
As manchas de H e E no sétimo ou oitavo dia mostraram repopulação do septo alveolar. A imunofluorescência em pé revelou fibroblastos pró-colágeno tipo I alfa 1 positivo, AEC2s ABCA3 positivos, células endoteliais CD31 positivas, ans abundantes SPB-positivoS AEC2s. Além disso, o ensaio de timmidina mostrou muitos AEC2s proliferando.
Essa técnica facilitou o desenvolvimento de estratégias para a engenharia de tecidos pulmonares e possibilitou investigações sobre filas que suportam a proliferação e diferenciação celular tipo II dentro do alvéolo.
