Visualizar a absorção de pequenas vesículas extracelulares, também conhecidas como sEVs, por diferentes células da medula espinhal, pode confirmar uma entrega bem sucedida de sEVs. Isso permite tanto estudos mecanicistas quanto terapêuticos de SEVs administrados intratecally de várias fontes em modelos de roden. Este protocolo pode ser usado para visualizar a absorção de sEVs por células em uma medula espinhal leve, e pode ajudar a avaliar o papel dos SEVs e suas moléculas de carga em distúrbios da coluna vertebral, dor e inflamação.
Este procedimento será demonstrado por mim, juntamente com Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, os dois estudantes de pós-graduação no laboratório da Dra. Comece colocando deslizamentos de cobertura de 18 milímetros na placa de 12 poços, em seguida, plaque células neuro-2a em cada poço com um total de 1 mililitro de DMEM completo contendo 10% FBS e estreptococos de 1% de caneta. Quando a fluência de contagem de células atingiu 80 a 90% mude o meio exososome médio para DMEM esgotado em cada poço adicione um, 5 ou 10 microgramas de sEVs rotulados.
Por 1, 4 e 24 horas. Para a dose e o tempo dependente de absorção para o resto dos poços em um volume igual de controle de corante. Colete os cérebros de filhotes pós-natais em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo solução de sal balanceada hanks balanceada com 10 milimões, disseque os lobos corticais e remova os meninges.
Em seguida, pique os tecidos com uma lâmina esterilizada. Transfira os tecidos para um tubo cônico de 15 mililitros contendo Pepane ou desoxiribonucleus um tampão de dissociação e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius, girando o tubo a cada 5 minutos, aspirar o supernatante e adicionar 5 mililitros de DMEM completo ao tubo. Para inativar a atividade enzimática, tente classificar cuidadosamente para dissociar os tecidos com uma pipeta sorológica de vidro de 5 mililitros e uma pipeta de pastagem polida de chama.
Passe a suspensão celular através de um coador de células de 40 micrômetros e, em seguida, centrífugue as células a 250 vezes G por 5 minutos a 4 graus Celsius, aspire o meio e veja as células em 10 mililitros de DMEM completo em um frasco de 75 centímetros quadrados. Após 4 horas de revestimento, substitua o supernato e o médio por 15 mililitros de meio DMEM fresco. Após 14 dias in vitro para desprender a microglia e os oligodendrócitos, transfira o frasco para um agitador orbital a 320 RPM por 6 horas.
Use 5 mililitros da enzima de dissociação celular por 10 minutos a 37 graus Celsius. Para tripsinizar, os astrócitos restantes, para inativar a ação enzimática, adicionar 5 mililitros de DMEM completo e, em seguida, pelotar as células a 250 vezes G por 5 minutos a 4 graus Celsius. Resuspenque as células em DMEM completo e veja as células nos deslizamentos de cobertura de 12 milímetros número 1,5 em uma placa de 24 poços.
Usando PBS enxágue as células 3 vezes e, em seguida, fixe-as com formaldeído de 4% de potência ou PFA em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave as células fixas 3 vezes por 5 minutos com PBS e permeabiliza-as usando 0,1% Triton X 100 em PBS por 10 a 15 minutos. Em seguida, repita as lavagens com PBS.
Use 5% de soro de cabra normal ou NGS em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear as células, incubar as células neuro-2a com anticorpos de duas vias de mapa e os astrócitos primários com anticorpos GFAP a uma proporção de 1 a 500 em 5%NGS frescos ou PBS durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave. Depois de lavar as células 3 vezes em PBS, adicione os anticorpos secundários conjugados fluorforo em 5% de NGS. Incubar por 2 horas à temperatura ambiente protegido da luz em um roqueiro.
Repita a lavagem com PBS e incubar a célula com 1 micrograma por mililitro de DAPI por 10 minutos em temperatura ambiente. Mais uma vez, lave as células 3 vezes com PBS. Usando um meio de montagem anti fade, monte os deslizamentos de cobertura nos slides número 1, deixe-os secar durante a noite no escuro e armazene os slides de vidro preparados a 4 graus Celsius até a imagem em um microscópio confocal.
Dissecar a medula espinhal e fixá-la em 4% PFA em PBS a 4 graus Celsius por 24 horas. Antes proteja os tecidos em 30% de sacarose em PBS a 4 graus Celsius por 24 horas ou até que os tecidos afundem e depois armazenem os tecidos a 4 graus Celsius até a imunohistoquímica, imbuíram a medula espinhal L4 L5 no composto octo, depois congele-os em gelo seco até que ele seja completamente solidificado. Use um criostat para secionar os tecidos a 30 micrômetros e coletar as seções em uma placa de 24 poços contendo PBS.
Lave as seções 3 vezes por 5 minutos cada uma com 0,3% Triton no PBS, bloqueie os locais de ligação não específicos usando 5%MGS em 0,3% Triton PBS por 2 horas à temperatura ambiente. Incubar as seções durante a noite a 4 graus Celsius em um shaker. Lave as seções 3 vezes por 5 minutos com 0,3% Triton em Pbs.
Em seguida, adicione a concentração apropriada dos anticorpos secundários. De acordo com o manuscrito do texto, incubar à temperatura ambiente por duas horas, lavar as seções usando apenas PBS e incuba-las em 1 micrograma por mililitro de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, repita as lavagens pbs sob um microscópio leve, monte as seções em um slide adesivo claro com um pincel fino.
Molhe o deslizamento de cobertura com o meio de montagem e cura durante a noite no escuro à temperatura ambiente, adquira imagens sob um microscópio confocal com os respectivos lasers, O tamanho médio de RA 2 6 4 0,7 sEVs derivados foi de 140 nanômetros e o tamanho da partícula máxima foi de 121,8 nanômetros. Com as partículas mais detectáveis caindo dentro da faixa de tamanho de exosóis ou sEVS. Com 50 a 150 nanômetros, a mancha ocidental de sEVs, Cell Lysate e exodepleted Media, demonstrou que as amostras de proteínas derivadas do SEV continham as proteínas marcadores sEV Alix CD81 e GAPDH.
O liseto celular foi enriquecido com tiquellum endoplasmático, proteína residente Calnexin assim Calnexin serviu como um marcador negativo para contaminação celular como estava ausente nos sEVs. Observou-se que a absorção de SEVs ocorreu em 1 hora e para os SEVs de 1, 5 e 10 microgramas, fluorescência pós incubação poderia ser detectada em 4 horas, para 4, 5 e 10 microgramas de sEVs. A absorção de SEVs rotulados PKH 26 por astrócitos primários foi examinada e a fluorescência máxima da absorção do SEVS em astrócitos corticais primários ocorreu às 24 horas de PKH26 sEVs rotulados e fluorescência máxima foi observada às 6 horas, pós-injeção em neurônios astrócitos e células microgliais.
A inclusão de controles, sEVs sem rótulo e controle de corante criam código para um vento falso positivo sinais recentes devido à agora específica rotulagem opry dança de unbound corantes costa. A absorção de seVs pode ser confirmada investigando a transferência de carga biomolecular para receitas e células e tecidos e determinando as mudanças nos níveis de expressão de biomoléculas ou genes-alvo. Estudos comportamentais também podem ser realizados, para investigar o impacto funcional da entrega do SEV.
