Este protocolo simples permite rotular EVs e monitorá-los através de microscopia confocal. Por exemplo, a imagem EV pode ajudar na avaliação da distribuição de EV ao usá-la na terapêutica. Esta técnica permite monitorar a migração e a absorção de EV facilmente em explants de cartilagem, com microscopia confocal sem qualquer função especial.
O mesmo protocolo pode ser usado para EVs para experimentos in vitro ou in vivo. Certifique-se de que as colunas sejam preparadas com antecedência, e que o volume inicial de EVs seja suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada, considerando que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante a etapa de purificação. Comece concentrando a vesícula extracelular, ou EV, amostra e o controle.
Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mililitros ou 500 microliters, dependendo do volume inicial da amostra de EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida. Suspenda as amostras concentradas de EV com 200 microlitres, e o grupo controle com 100 microlitres de C diluído, e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mililitro.
Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 microliters cada. Marque uma das alíquotas com corante e use-a como tratamento. Deixe o outro sem identificação, mas processe-o como a amostra EV, e use-a para quantificar a concentração de EV por análise de rastreamento de nanopartículas.
Prepare a solução de corante 2x de modo que a concentração resultante da solução PKH26 em C diluído seja de oito micromolar. Misture um microliter de um divisor PKH26 por 125 microlitres de C diluído na amostra. Prepare o volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.
Adicione a solução de corante 2x aos EVs derivados de plaquetas PKH e controle amostras em uma proporção de 1:1, para atingir 1x de concentração de corante, e quatro concentrações de PKH26 micromolar. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra de EV derivada da plaqueta NTA. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.
Adicione 5% de solução de albumina-PBS de soro bovino às amostras em uma proporção de 1:1, e certifique-se de que o volume final seja de aproximadamente 400 microliters. Prossiga para separar os EVs rotulados das interações de corante não vinculado e corante não específico com a coluna. Remova a tampa da coluna, adicione 400 microliters de EVs derivados de plaquetas PKH, EVs derivados de plaquetas NTA ou controle e descarte todo o líquido elucido.
Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 microliters de PBS e descarte todo o líquido elucido. Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa.
Adicione 600 microliters de PBS e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Para uma nova coluna, repita as etapas envolvendo a concentração das amostras mencionadas no início do protocolo. Adicione 600 microliters de EVs previamente elucidos à coluna e descarte o volume elucido.
Em seguida, adicione 400 microliters de PBS e descarte todos os volumes elucidos. Adicione 600 microliters de PBS à coluna e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extive-a usando um soco de biópsia de três milímetros de diâmetro em condições estéreis.
Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12, suplementada com estreptomicina de penicilina de 1%a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 80% de umidade. Para estabelecer um modelo de OA orientado pela inflamação, suplementar o meio de cultura celular com 10 nanogramas por mililitro de oncostatina M e dois nanogramas por mililitro de fator de necrose tumoral-alfa. Trate as explantas com 1 vezes 10 a 900 por poço de EVs derivados de plaquetas PKH, ou controle, em meio de cultura celular suplementado com oncostatina M e fator de necrose tumoral-alfa.
Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 microliters do meio de cultura celular a cada poço descrito no manuscrito. Pare o ensaio in vitro a cada hora de zero a cinco horas.
Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 microliters de PBS. Adicione 100 microlitadores de 4%de paraformaldeído ao tecido para corrigi-lo por três horas a quatro graus Celsius. Remova o PFA, adicione 100 microliters de PBS, armazene o tecido fixo a quatro graus Celsius e processe as amostras dentro de 48 horas.
Imagens tiradas em diferentes pontos de tempo mostram como os EVs entram no tecido até chegarem aos condrócitos, e entram nos condrócitos ao longo do tempo. Os EVs rotulados já estavam localizados em torno de condrócitos após uma hora de incubação. Certifique-se de que o volume inicial de EVs é suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada.
Outra coisa importante a se lembrar é usar os EVs rotulados nas próximas 24 horas. Se não usá-lo dentro de 24 horas, pode ocorrer uma diminuição da fluorescência. Essa técnica ajudará os pesquisadores a melhorar a imagem EV e a estudar EVs em biologia e terapêutica.
