Este protocolo fornece uma técnica para detectar as proteínas salivares de cigarrinhas e hospedeiros de plantas para investigar a função dessas proteínas nos hospedeiros vegetais. Esta técnica é fácil de executar e o sistema é estável e replicável. Este método também pode ser útil na detecção de proteínas salivares de outros hemipteros e hospedeiros vegetais.
Para começar, crie as cigarrinhas adultas em mudas de arroz em uma gaiola cubal de 40 por 35 por 20 centímetros. Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação. Coloque as gaiolas com as cigarrinhas em uma incubadora contendo um controlador de umidade embutido a 26 graus Celsius com uma umidade relativa de 60 a 75% sob um período fotográfico de 16 horas claro e oito horas escuro.
Uma vez por semana, use um aspirador para transferir suavemente todos os adultos de sua gaiola para uma nova gaiola contendo mudas frescas de arroz. Permita que mais de 200 adultos acasalem e coloquem ovos no arroz. Retenha as mudas velhas de arroz para que as ninfas surjam e crie essas novas ninfas não virulíferas para o estágio de segundo ínstar.
Usando o aspirador, transfira cuidadosamente as ninfas não virulíferas do segundo ínstar para um tubo de cultura de vidro por uma a duas horas para inanição. Em seguida, solte as ninfas em uma gaiola contendo uma planta de arroz infectada pelo vírus anão do arroz cultivada em um vaso e permita que as ninfas se alimentem da planta de arroz infectada por dois dias. Após dois dias, transfira cuidadosamente essas ninfas para uma nova gaiola que contenha mudas frescas de arroz livres de vírus e permita que as ninfas se alimentem das mudas de arroz livres de vírus por 12 dias para completar o período de transmissão circulante do vírus anão do arroz.
Para coletar as proteínas salivares, prepare cinco pequenas gaiolas de alimentação semelhantes a tubos cobertas com redes à prova de insetos em uma extremidade. Depois de confinar 15 a 20 cigarrinhas em cada gaiola de alimentação, cubra a outra extremidade da gaiola com uma esteira de espuma fina. Fixar uma muda de arroz entre a extremidade da gaiola e uma esteira de espuma com fitas adesivas, garantindo que as cigarrinhas na gaiola de alimentação possam se alimentar das mudas de arroz expostas ao interior da gaiola.
Mergulhe as raízes da muda em água para que a planta de arroz permaneça viva e permita que as cigarrinhas se alimentem delas por dois dias. Após dois dias, retire as cigarrinhas de suas gaiolas de alimentação e colete as mudas de arroz nas quais as cigarrinhas se alimentaram. Corte as mudas fora da gaiola e recupere as regiões de alimentação das mudas.
Preparar 1x tampão Tris-Glycine diluindo 200 mililitros do tampão preparado 5x com 800 mililitros de água estéril. Em seguida, prepare o tampão TBS 10x e autoclave a solução a 121 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, prepare o tampão de amostra de proteína 4x.
Em seguida, prepare o tampão de transferência misturando 800 mililitros do tampão Tris-Glycine com 200 mililitros de metanol. Finalmente, prepare a solução TBST adicionando 100 mililitros de 10x TBS e três mililitros de Tween 20 a 900 mililitros de água estéril. Para detectar as proteínas salivares e virais, triture 0,1 gramas das amostras de arroz com nitrogênio líquido até que o tecido se torne um pó.
Em seguida, adicione 200 microlitros do tampão de amostra de proteína 4x à amostra e ferva por 10 minutos. Centrifugar as amostras e transferir o sobrenadante para um novo frasco para injetáveis. Coloque 10 microlitros da amostra em um gel SDS-PAGE e execute-a em tampão Tris-Glycine a 150 volts por 45 a 60 minutos.
Enquanto o gel estiver funcionando, coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,45 mícron e outros suprimentos de sanduíche no tampão de transferência por 30 minutos. Após a corrida, sanduíche o gel e transfira-o por 90 a 120 minutos a 100 volts no buffer de transferência. Após a limpeza completa, coloque a membrana em uma solução de bloqueio de leite seco a 7% sem gordura em TBST e incube por 20 minutos.
Depois disso, adicione um anticorpo contra o vírus anão do arroz P8 ou vitelogenina e incube a membrana por duas horas ou durante a noite. Após a incubação, lavar a membrana com TBST três vezes com uma incubação de cinco minutos entre cada lavagem. Em seguida, adicione IgG de cabra anti-coelho como anticorpo secundário e incube a membrana por 60 a 90 minutos.
Use o kit ECL Western para detecção quimioluminescente em reagentes de detecção mistos um e dois no kit na proporção de um para um. Coloque a membrana sobre o reagente misto e incube a mancha por cinco minutos. Escorra o excesso de reagente e tire uma imagem quimioluminescente e colorimétrica da membrana.
Combine as imagens para ver o último com bandas de proteína. A análise de Western blot para detecção de vitelogenina mostrou bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 quilodaltons na alimentação de plantas de arroz e glândulas salivares dos insetos. Em contraste, nenhuma banda foi observada nas plantas não-alimentadoras, indicando que a vitelogenina foi liberada no hospedeiro vegetal como proteína salivar.
A análise de Western blot para detecção da proteína P8 do vírus anão do arroz mostrou uma banda específica e esperada de aproximadamente 46 quilodaltons em plantas alimentadoras e corpos de insetos virulíferos. Em contraste, nenhuma banda foi observada em plantas não alimentadoras e corpos de cigarrinhas não virulíferos, provando que as proteínas virais também podem ser detectadas nas plantas alimentadoras. A carga viral nas cigarrinhas, o tempo de detecção e as réplicas devem ser levados em consideração durante a realização deste protocolo.
Este método também pode ser aplicado para estudar mosquitos que transmitem arbovírus.
