Alongado e polarizado o ameloblasto secretor de amelogenina na cultura. Este é também o primeiro protocolo para o crescimento de células de ameloblastos em microgravidade. O crescimento dos ameloblastos na cultura tem sido um dos maiores desafios no campo do esmalte.
E para nós, está usando esse modelo de biorreator, é a primeira vez que alcançamos essa marca registrada na pesquisa de esmalte. Este modelo pode ser usado para entender a biologia das células ameloblásticas. Este modelo será demonstrado pela Dra. Mirali Pandya.
Comece colocando o tecido coletado de camundongos pós-natais de seis dias sob o microscópio de dissecção e alças cervicais dissecadas. Configure um biorreator conectando as válvulas estéreis às portas da seringa. Adicione ambas as células, a alça cervical e a polpa dentária, juntamente com o andaime revestido ao biorreator e encha o vaso do biorreator com 10 mililitros de meio SFM de queratinócitos suplementados com fatores de crescimento e proteínas da matriz extracelular.
Feche e aperte a tampa da porta de enchimento do recipiente do biorreator e, em seguida, abra as válvulas estéreis. Use duas seringas estéreis de três mililitros para uma mudança de mídia. Para tal, encha uma seringa com o meio fresco e deixe a outra seringa vazia.
Abra ambas as válvulas da seringa e manobrar suavemente as bolhas em direção à porta da seringa vazia. Uma vez que o meio fresco da seringa cheia é cuidadosamente injetado no recipiente, remova todas as bolhas através da porta da seringa vazia. Feche as portas da seringa com tampas.
Fixar cada recipiente à base do rotador. Ligue a alimentação e defina a velocidade para 10,1 rotações por minuto. Ajuste a velocidade para garantir que os andaimes estejam em suspensão e não toquem na parede da embarcação.
Para a troca de meios a cada 24 horas, coloque os vasos na posição vertical para garantir que as células se depositem no fundo. Abra as portas da seringa para ligar as seringas estéreis às portas. Aspirar 75% do meio esgotado em nutrição e injetar o meio fresco através da outra porta, como demonstrado anteriormente.
As macrografias de andaimes de grafeno e andaimes de colágeno são mostradas aqui. O andaime de grafeno tinha uma matriz paralela de relevos de superfície, enquanto o andaime de colágeno exibia a estrutura porosa. Uma mandíbula esqueletizada foi dissecada e a porção mais distal do incisivo inferior do camundongo foi exposta.
A posição precisa da alça cervical ressecada é demarcada no incisivo de camundongo pós-natal de seis dias, enquanto uma região semelhante em uma mandíbula adulta esqueletizada de camundongo é fornecida como referência. As hemimandíbulas eram compostas por três molares mandibulares e um incisivo em constante crescimento, enquanto o nicho de células da alça cervical continha uma população celular variada necessária para a formação do esmalte. A diferenciação bem-sucedida das células da alça cervical em um microambiente adaptado resultou na formação de ameloblastos com uma característica típica de células polarizadas com o núcleo em uma extremidade e longos processos celulares na outra.
A cultura de células em meios isoladamente sem fatores de crescimento e revestimento de andaime resultou em células de alça cervical que secretaram proteínas-chave do esmalte, mas não alongaram ou polarizaram. O grupo de andaimes revestidos de galanina demonstrou uma taxa de proliferação significativamente maior em comparação com o grupo controle contendo andaimes não revestidos. Os segmentos de tecido pulmonar colhidos de camundongos E15 foram cultivados com sucesso por 10 dias em um ambiente de microgravidade 3D no biorreator.
A adição de interleucina-6 ao meio de cultura resultou em alterações associadas à inflamação na morfologia alveolar semelhantes às observadas in vivo. Na introdução, eu disse o quão difícil foi para a equipe de esmalte criar um modelo de cultura de células de ameloblasto. Agora, abordamos esse desafio usando um procedimento altamente inovador que se concentra em dois aspectos: andaime de colágeno de esponja e também o emprego de matriz para diferenciar as células do ameloblasto.
Juntas, essas duas inovações resultaram na polarização e crescimento de células semelhantes a ameloblastos em cultura 3D. Essas células cultivadas em 3D são um modelo maravilhoso para entender a biologia dos ameloblastos. E para entender essa biologia, podemos usar uma variedade de técnicas, incluindo microscopia eletrônica, proteômica e genômica.
Os ameloblastos são células fantásticas. Sim, eles têm a capacidade de secretar esmalte dentário prismático. Agora, esse modelo de biorreator nos coloca na posição de entender como os ameloblastos secretam matriz e secretam minerais de apatita para cultivar o esmalte dentário prismático.
