Este protocolo usa células-tronco pluripotentes induzidas para diferenciá-las em células pulmonares, a fim de modelar doenças pulmonares humanas e desenvolvimento em um prato. Este protocolo é significativo porque é difícil obter e cultivar tecido pulmonar humano primário. A principal vantagem de diferenciar células pulmonares das células-tronco pluripotentes é ter um suprimento constante de células pulmonares específicas para estudar o desenvolvimento pulmonar humano e doenças.
Essas células podem ser mantidas na cultura celular por longos períodos de tempo, podem ser criopreservadas para aplicações futuras, e podem ser geneticamente manipuladas para estudar mutações genéticas. Demonstrando o procedimento será Rachel McVicar, uma doutoranda do meu laboratório. Antes de iniciar o experimento, descongele lentamente um fator de crescimento reduzido, ou GFR, meio de matriz de membrana de porão no gelo, e dilui-o em um volume igual de DMEM F12 frio.
Coloque as pontas P1000 no congelador para esfriar antes de usar. Em seguida, cubra cada poço de uma placa de 12 poços com 500 microliters do meio de matriz de membrana de porão de 50% GFR, e remova qualquer mistura média e bolhas em excesso dos poços. Coloque as placas do poço em cima de gelo molhado ou uma geladeira a quatro graus Celsius para definir por 20 minutos, em seguida, mova a placa para a incubadora Celsius de 37 graus durante a noite.
Quando os PSEs elevados atingirem 70% de confluência, adicione 10 micromolars inibidores de ROCHA Y27632 às células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e espere uma hora antes da dissociação. Aspire a mídia e lave as células uma vez com PVS. Dissociar IPSCs adicionando 500 microliters de meio de descolamento celular por poço, e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%.
Após a incubação, adicione 500 microliters de meio de passagem de células-tronco por poço. Células de pipeta suavemente usando uma ponta P1000 para obter uma única suspensão celular. Em seguida, transfira as células dissociadas em um tubo de 15 mililitros e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes G.Após a centrifugação, aspire o meio e resuspengue a pelota celular com um mililitro de mídia mTeSR Plus complementada com 10 inibidores ROCK micromolar.
Depois de contar as células, adicione duas vezes 10 aos quintos IPSCs a cada poço de uma placa revestida média de 12 bem GFR, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspire o mTeSR Plus antes de adicionar endoderm definitivo, ou DE, mídia de indução. Nos dias dois e três, mude a mídia de indução de DE.
No quarto dia, inicie a indução da AFE substituindo a mídia de indução DE por meio basal sem soro. Mude o meio AFE diariamente por três dias antes de analisar a eficiência da AFE no final do sexto dia. No sétimo dia, descongele a matriz de membrana do porão GFR no gelo para uso posterior.
Simultaneamente, proceda com a diferenciação de células progenitoras pulmonares aspirando a mídia AFE e lavando os poços com PVS. Adicione um mililitro de solução de desprendimento celular ao poço e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione um mililitro de mídia saciada aos Poços contendo solução de descolamento celular.
Mantenha as células como agregados, encanar suavemente para cima e para baixo. Certifique-se de que todas as células estão desalojadas, mas para transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação a 300 vezes G por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspenque a pelota celular em mídia de indução LPC.
Conte as células, e adicione 2,5 vezes 10 às quintas células a 100 microliters de meio de matriz de membrana de porão GFR frio, e misture bem. Coloque uma gota em um poço de uma placa de 12 poços e incubar a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de mídia LPC por poço, garantindo que a queda média esteja totalmente submersa e incubada durante a noite a 37 graus Celsius.
No oitavo dia, mude o meio LPC para remover o inibidor de ROCHA Y27632. Continue mudando a mídia a cada dois dias e analise a eficiência do LPC no final do dia 16. No dia 17, lave os poços e adicione 500 microliters de dois microgramas por mililitro.
Pipetar a mistura dispase com uma pipeta P1000 e incubar por 15 minutos, depois pipetar a mistura e incubar por mais 15 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro da mídia saciante ao despasco contendo poços, e transfira as células em tubos cônicos. Centrifugar e resuspencar a pelota em um mililitro de PVS refrigerado, em seguida, repita a centrifugação.
Em seguida, resuspende a pelota em um mililitro de meio de desprendimento celular. Incubar as células a 37 graus Celsius por 12 minutos, em seguida, adicione um volume igual de mídia saciada e centrífuga novamente. Resuspend a pelota em um mililitro de mídia saciante e 10 micromolar inibidor rock Y27632.
Realize uma contagem de células para calcular o volume necessário para obter oito vezes 10 para as quatro células por poço. Em seguida, a alíquota exigiu volume de agregados celulares LPC em tubos de micro centrífugas de 1,5 mililitros e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes G.Remova o excesso de supernanato sem agitar a pelota celular, deixando 10 microliters de mídia residual. Resuspend a pelota celular em 200 microliters de frio GFR porão membrana meio e transferir as células para as pastilhas de membrana de cultura celular.
Incubar a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de meio de indução organoide 3D à câmara basolateral da inserção, e substitua-o por meio fresco a cada dois dias durante seis dias. No dia 23, mude o meio de ramificação médio para 3D e troque o meio a cada dois dias durante seis dias.
No dia 29, mude para meio de maturação 3D, e continue substituindo o meio a cada dois dias pelos próximos seis dias. No quarto dia de indução DE, as células anexadas exibem uma morfologia compacta de paralelepípedos. Os marcadores de endoderme definitivoS CXCR4 e SOX17 sobrepostos com núcleos foram expressos, confirmando a diferenciação endodérmica.
A indução anterior de foregut foi confirmada no sétimo dia com a morfologia mostrando células mais bem compactadas, e os marcadores FOXA2 e SOX2 sobrepostos com núcleos. A geração de células progenitoras pulmonares 3D foi confirmada com esferoides 3D, e a expressão endógena de NKX2-1 GFP em uma linha celular repórter. Após três semanas de diferenciação em organoides pulmonares inteiros, os marcadores pulmonares foram analisados por imunocitoquímica.
Marcadores para ramificação da morfogênese SOX2 e SOX9 sobrepostos por núcleos foram observados nos organoides. Os marcadores pulmonares proximais P63 e KRT5, ambos marcadores de células basais, foram detectados com sucesso junto com o SCGB3A2, que é um marcador para células do clube. Marcadores pulmonares distais induziram marcadores Pro SPC e SPB para células Alveolar Tipo II.
E marcadores HOPX de células Alveolar Tipo I. Além disso, NKX2-1 e ZO1 foram expressos sobrepostos com núcleos. Os marcadores de células pulmonares de Mesenchyme PGFR Alpha, um marcador para fibroblastos, co-expressos com SOX9, representavam mesenquime distal.
Vimentin também foi expressa e foi dispersada por todo o pulmão. Após este procedimento, os organoides pulmonares podem ser investidos com células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de células endoteliais e imunes. O desenvolvimento pulmonar e a doença ocorrem por uma sinalização entre as populações epiteliais e células mesenquimais, mas também de células endoteliais e macrófagos.
Um sistema modelo de tecido pulmonar 3D é clinicamente relevante para estudar doenças humanas e terapêuticas.
