Nosso protocolo pode ser usado para melhorar a qualidade e a quantidade de dados de expressão genética gerados a partir de amostras de RNA derivadas do FFPE, especialmente em amostras de qualidade subótima. Esta técnica avalia a qualidade do RNA dentro das amostras de tecido FFPE e permite a otimização de seu processamento a jusante para melhorar a quantidade e a qualidade dos dados de sequenciamento da amostra. Este método permite a caracterização abrangente de uma transcrição em amostra biológica e clínica e pode fornecer insights sobre elementos funcionais do genoma em desenvolvimento e doenças.
A degradação do FFPE-RNA e a seleção dos métodos para QC amostral, preparação da biblioteca e análise de dados podem ser muito complicadas. Seja meticuloso ao selecionar os métodos certos e controles apropriados. A demonstração visual permite que os espectadores observem as pequenas modificações sutis e precauções necessárias durante o planejamento, avaliação e o processo de sequenciamento especialmente para amostras de FFPE mal preservadas.
Para verificar a qualidade da amostra de RNA, execute a amostra em um sistema RNA QC de acordo com as instruções do fabricante e use o software de bioanálise apropriado para analisar a distribuição dos fragmentos de RNA dentro da amostra e calcular a proporção de fragmentos maiores que 100 e 200 nucleotídeos. Com base nas métricas do QC, identifique as amostras com menos de 40% dos fragmentos com mais de 100 nucleotídeos para permitir a exclusão dessas amostras do processamento. Para sequenciamento, descongele os kits apropriados de sequenciamento de reagente de acordo com os parâmetros de execução em um banho de água de temperatura ambiente e coloque a bandeja de reagente a quatro graus Celsius após o descongelamento.
Coloque o pacote da célula de fluxo em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto o pacote estiver aquecendo, abra o aplicativo Illumina Experiment Manager e selecione Criar folha de amostra. Selecione o sequenciador a ser usado e clique em Next.
Digite o código de barras do kit de reagente e os outros parâmetros apropriados de fluxo de trabalho. Em seguida, carregue uma folha de amostra criada de acordo com os critérios de sequência de Illumina. Para preparar a biblioteca de amostras e a biblioteca de controle PhiX, desnaturar e diluir as bibliotecas para as concentrações apropriadas e misturar as bibliotecas de controle amostral e PhiX para obter uma razão de volume de controle PhiX de 5%.
Quando as células de fluxo estiverem prontas, remova o embrulho, limpe a superfície do vidro com um lenço de álcool sem fiapos e seque o vidro com um tecido de laboratório de fiapos baixos. Remova o cartucho de reagente de quatro graus Celsius de armazenamento e inverta o cartucho cinco vezes para misturar os reagentes. Toque suavemente o cartucho no banco para reduzir as bolhas de ar e carregue a amostra desnaturada e diluída no cartucho de reagente no reservatório designado.
Carregue a célula de fluxo, o cartucho tampão e o cartucho do reagente no sistema. Em seguida, realize uma verificação automatizada e revise a saída para garantir que os parâmetros de execução passem pela verificação do sistema. Quando a verificação automatizada estiver concluída, selecione iniciar a execução de sequenciamento.
Para visualizar os resultados de QC pré-processamento e QC pós-alinhamento, execute vários QCs para gerar um relatório agregado em formato HTML. Para determinar os efeitos em lote e avaliar o mapa de qualidade do conjunto de dados dado, use um script R para executar uma análise de componente principal. A análise da correlação amostral pode então ser realizada utilizando-se a correlação de Pearson entre diferentes amostras.
A estimativa da proporção de fragmentos com mais de 100 nucleotídeos é mais útil do que uma estimativa dos fragmentos com mais de 200 nucleotídeos, pois é mais sensível para medir com precisão a proporção de tamanhos de fragmentos menores para amostras de RNA altamente degradadas. Dado o alto grau de degradação no conjunto amostral, recomenda-se um método total de preparação da biblioteca de RNA. Por exemplo, aqui são mostradas bibliotecas de sequenciamento preparadas a partir de quatro amostras diferentes.
Aqui, são mostradas visões gerais da qualidade de sequenciamento de arquivos FastQ bruta e conteúdo do adaptador de amostra. A triagem fastqc pode ajudar a detectar contaminação, como contaminação bacteriana ou de camundongos dentro das amostras. O alinhamento estelar pode ser usado para determinar a proporção de leituras mapeadas para o genoma de referência, a porcentagem de leituras mapeadas exclusivamente para o genoma de referência, e a proporção de leituras que não foram mapeadas, ou que foram mapeadas para vários loci.
As estatísticas do cartão e do RSeQC podem ser usadas para determinar a porcentagem de RNAs mensageiros, bases intronicas e intergênicas presentes nas leituras mapeadas. Para essas análises representativas, algumas bibliotecas degradadas tinham um viés de três primos em que mais leituras foram mapeadas mais perto dos três primos do que do fim cinco primos. Além disso, a análise dos componentes principais pode ser realizada para determinar a porcentagem da variação total capturada pelos componentes principais para as réplicas biológicas de cada amostra.
Tome cuidado para evitar a degradação da amostra, prepare réplicas e vários casacos para cada amostra, use as métricas apropriadas para avaliar a qualidade da amostra e use o método de preparação da biblioteca correta. Utilizando essa metodologia, estudos maiores de NGS podem ser realizados com amostras de FFPE anteriormente inutilizáveis com diferentes tempos de armazenamento e condições para obter insights sobre uma variedade de diferentes estados da doença. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem grandes arquivos existentes da amostra FFPE com informações clínicas ricas e podem melhorar muito os estudos sobre câncer de base populacional.
