Este método fornece uma rápida e alta detecção de adesão de bactérias às células hospedeiras. Em comparação com os métodos convencionais de revestimento, reduz o tempo prático necessário para a quantificação das bactérias aderentes. Esta técnica é automatizada, que economiza tempo e muito reproduzível.
Também é amplamente aplicado tanto na maioria das células hospedeiras. Este método, é muito simples. Para o primeiro ensaio, as condições como a multiplicidade de infecção, e também o tempo de co-incubação de bactérias hospedeiras devem ser otimizadas.
Primeiro colher as culturas bacterianas em uma fase exponencial por centrifugação a 13.000 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar a paleta de células com um MILilitro PBS, resuspense a paleta bacteriana em um PBS mililitro. Determine as concentrações de suspensão bacteriana medindo a densidade óptica em 600 nanômetros.
Em seguida, para colorir a suspensão bacteriana, adicione dois microliters do estoque concentrado de 500 vezes de corante verde ou vermelho em um mililitro de suspensão bacteriana para diluir o corante uma dobra. Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos com rotação suave no escuro. Após 30 minutos, centrifugar a bactéria manchada a 13.000 vezes G por dois minutos e resuspensar a pelota em um mililitro de PBS.
Colete as células bacterianas manchadas por centrifugação a 13.000 vezes G por dois minutos. Resuspende a pelota em um mililitro de médio F12 K fresco e meça a densidade óptica de cada cultura em 600 nanômetros. Posteriormente diluir as culturas às concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção e concentração celular hospedeira.
Para o ensaio de adesão bacteriana, lave as camadas mono de células A549 previamente cultivadas três vezes adicionando 100 microliters de PBS quente a cada poço e delicadamente pipeta para cima e para baixo. Em seguida, descarte PBS. Alternativamente, depois de adicionar PBS, aguarde 10 segundos e, em seguida, remova o PBS usando vácuo.
Para determinar a cinética da associação bacteriana, sobreponha as células com 100 microliters de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes multiplicidade de infecção. Desça as bactérias e incuba as células A549 infectadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por mais uma hora. Remova as bactérias ilimitadas lavando as camadas mono cinco vezes com PBS quente, como demonstrado.
Em seguida, conserte as células adicionando 100 microlitrais de 4% de formaldeído em todos os poços de uma placa de 96 poços no gelo. Após 15 minutos, lave a placa três vezes com PBS para remover a solução de fixação. Mancha nos núcleos com 50 nanogramas por mancha de DAPI mililitro por 10 minutos à temperatura ambiente.
Depois de lavar as células com PBS, cubra as células A549 infectadas com 100 microliters de PBS para evitar a secagem e, em seguida, armazene a placa a quatro graus Celsius por até dois dias no escuro ou prossiga para a imagem. Para manter a integridade dos dados, escolha aleatoriamente e manualmente cinco locais de cada poço para capturar as imagens em 20 vezes a ampliação. Capture as imagens fluorescentes de bactérias sob canais GFP, células A549 sob DAPI, e para as bactérias manchadas pelo corante fluorescente vermelho use pe si cinco canal.
Defina os parâmetros da bola rolante para suavizar e medir automaticamente a função de propagação de pontos da desconvolução da imagem com base no objetivo de alcançar uma melhor resolução. Meça a intensidade da fluorescência das células hospedeiras e bactérias. Defina a intensidade de fluorescência mais fraca das células hospedeiras e bactérias como os limiares para a contagem de células e conte todas as bactérias próximas a uma célula hospedeira dentro de 15 micrômetros de distância como as bactérias de adesão.
Uma vez que as células tenham sido contadas a partir de todas as imagens automatizadas, analise leituras críticas, como contagem de células hospedeiras, tamanhos e formas de células, contagem total de bactérias e a conta bacteriana média por célula hospedeira, que é o indicador mais importante para determinar a adesão bacteriana. Após uma hora de co incubação, pseudomonas aeruginosa cepa PAO1 aderiu às células A549 de forma dependente. Resultados semelhantes também foram observados quando as bactérias gram-positivas listeria monocytogenes e seu controle negativo bacilo subtilis.
Uma imagem representativa da segmentação P aeruginosa aderente demonstra a facilidade de contar células bacterianas usando este protocolo. Os resultados das análises automatizadas incluem contagens de células bacterianas e hospedeiras, contagem média de bactérias por célula hospedeira e tamanhos de células hospedeiras e áreas que representam o status da saúde das células hospedeiras, nível de adesão bacteriana e toxicidade de cito bacteriano. Além das células A549, os HUVECs também foram testados para ensaio de adesão.
Serratia rubidaea e estreptococo agalactiae foram aderentes ao HUVEC, mas não às células A549, e o que demonstra a efetiva detecção e adequação de vários hospedeiros para estudar as interações de bactérias hospedeiras usando este método. As células hospedeiras devem atingir cerca de 90 a 100% de confluência para minimizar a indesejável adesão de bactérias ao fundo dos poços. Essa técnica permitirá aos pesquisadores explorar os novos mecanismos, as interações hospedeira-peste.
