Este protocolo mostra a metodologia adequada para o corte e a coloração de tecidos cardíacos e cerebrais. Também fornece diretrizes para estabelecer configurações de iluminação e câmera e técnicas de fotografia para aquisição de imagens. Esses métodos são particularmente úteis para a realização de medições na análise planimétrica de imagem em tecidos de roedores, e podem ser de valor para a macrofotografia científica geral.
Para começar, desprender a cânula do coração da seringa cheia de solução Krebs-Henseleit e conectada a uma seringa cheia de solução quente Krebs-Henseleit contendo azul de metileno de 0,1%. Perfunda o coração de rato com quatro mililitros da solução azul de metileno a uma taxa de quatro mililitros por minuto. Depois de desconectar a cânula da seringa e remover o coração da cânula, remova o excesso de azul de metileno rolando suavemente o coração sobre papel de tecido.
Depois de remover o excesso de azul metileno, solte a ligadura ao redor da artéria coronária abrindo as fórceps hemostáticas e removendo o tubo plástico ao redor da sutura cirúrgica. Em seguida, coloque o coração de rato manchado em uma matriz de aço inoxidável para cortar. Corte os ventrículos em fatias de dois milímetros de espessura, visando de seis a sete fatias de um coração de rato adulto.
Após o corte, transfira as fatias para um tubo plástico de 15 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de 1%de tríol tetrazolium cloreto dissolvido em PBS ao tubo com as fatias do coração e incubar por 10 minutos em um banho de água a 37 graus Celsius com mistura suave após cinco minutos. Após a incubação, lave as fatias do coração pelo menos duas a três vezes com PBS e prepare-se para a captura da imagem.
Depois de remover o cérebro, incluindo o tronco cerebral, do crânio, coloque o cérebro com seu lado ventral para cima na matriz cerebral. Dependendo do peso dos animais, escolha o tamanho correto da matriz de aço inoxidável do cérebro. Usando lâminas, restrinja as partes frontal e caudal do cérebro.
Em seguida, coloque as lâminas parcialmente nos canais entre a primeira e as últimas lâminas. Quando todas as lâminas forem inseridas e dispostas em paralelo, pressione todas as lâminas para baixo com a palma ao mesmo tempo para cortar o cérebro em fatias coronais de dois milímetros. Em seguida, segure as lâminas firmemente ao longo dos lados com dois dedos e remova-as juntamente com o cérebro fatiado da matriz.
Organize as fatias cerebrais uma a uma em uma bandeja, garantindo que a superfície interior de cada fatia esteja sempre voltada para cima. Em seguida, despeje a solução quente de cloreto de tetrazolium de 1%triphenyl e PBS nas fatias cerebrais e incubar por oito minutos a 37 graus Celsius no escuro. Após a incubação, transfira as fatias cerebrais em uma bandeja de plástico azul para capturar imagens.
Disponha as fatias cerebrais em ordem sequencial da parte frontal para a parte caudal e use um bisturi para separar os hemisférios no plano sagital. Fotografe as fatias de tecido imediatamente após a coloração. Configure a câmera escolhida com uma bateria carregada, cartão de memória e lente anexada em um suporte.
Dependendo das fontes de luz disponíveis, selecione as configurações apropriadas de balanço de branco ou realize a calibração da temperatura da cor de acordo com as instruções do manual da câmera. Mergulhe completamente as fatias do coração em um recipiente com PBS. Disponha as fatias cerebrais em uma bandeja seca sem PBS ou outros líquidos.
Coloque o recipiente com fatias sob a câmera com a lente macro. Certifique-se de que todas as fatias se encaixam totalmente no campo de visão e estão no mesmo plano. Mude a câmera para o modo totalmente manual, defina o ISO 100 e a abertura para F10.
Ajuste a velocidade do obturador para uma exposição ideal da imagem e certifique-se de que o plano focal da câmera esteja paralelo à superfície onde a amostra está colocada. Depois de capturar o número da amostra, gire o filtro de polarização circular até que os reflexos desapareçam, e exapareçam a fatia de tecido usando um gatilho remoto para evitar que uma câmera trema quando o obturador é liberado, gire as fatias e capture imagens do outro lado. Esta fotografia de uma fatia de coração manchada de tillazolium azul metileno e triphenyl após o infarto do miocárdio contém detalhes e informações de cores suficientes para uma análise planimétrica adicional do tamanho do infarto.
O congelamento do tecido cardíaco por 24 horas afeta a integridade e reduz a função mitocondrial. Assim, a coloração do cloreto de tetrazolium triphenyl do coração não é vermelha, mas rosa pálida, e a borda entre os tecidos necrosados e viáveis é borrada. Dos dois métodos comparados para a redução das reflexões nos espécimes, a imersão é o método mais eficiente e produz imagens detalhadas com bom contraste.
O filtro de polarização também é eficaz, no entanto, reduz ligeiramente a resolução e microcontrast da imagem. Uma imagem de uma fatia de coração sem imersão ou filtro contém muitas reflexões e não é adequada para análises posteriores. Na análise planimétrica, o lado não afetado do cérebro deve ser comparado com o lado afetado pelo derrame.
As configurações manuais da câmera garantem a exposição ideal e o balanço de branco de todas as imagens, permitindo análise uniforme. Exemplos de imagens superexpostas e subexpostas de fatias de coração são mostrados aqui. Além disso, as configurações incorretas de equilíbrio de branco resultam em uma mudança para azul ou amarelo e magenta ou verde na imagem.
A macrofotografia científica requer iluminação controlada e uma configuração de imagem apropriada. A metodologia padronizada garante imagens digitais detalhadas e de alta qualidade. Este método é aplicável a toda fotografia experimental de pequenos órgãos animais.
