Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas. A existência de diversas abordagens diferentes dificulta a comparação de resultados gerados por diferentes laboratórios. Nossa estratégia de gating fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes pulmonares e não mieloides usando nove marcadores.
O presente protocolo descreve a caracterização e identificação de populações imunes pulmonares em condições de estado estável. No entanto, este protocolo pode ser empregado para identificar alterações dessas populações de células em vários modelos de doenças, onde pode ajudar a identificar alterações específicas da doença da paisagem imunológica pulmonar. Os pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez devem prestar atenção às condições de digestão e reagentes, pois fazem uma grande diferença na liberação de células imunes do tecido pulmonar.
Comece preparando o animal eutanizado para a cirurgia. Estabilize o rato dorsalmente usando agulhas ou fitas nas quatro extremidades, depois use 70% de etanol para higienizar a pele da área ventral. Faça uma incisão do pescoço para o abdômen.
Remova a pele da área torácica, juntamente com as costelas e o esterno. Lave os pulmões injetando 10 mililitros de PBS frio no ventrículo direito usando uma agulha de 18 a 21 graus até ficarem completamente brancos. Em seguida, remova o timo e o coração sem tocar nos pulmões.
Retire os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo contendo tampão BSA frio. Transfira o pulmão para uma placa de Petri, pique-o usando dois bisturis finos, e, em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão de digestão para lavar a placa.
Fixar a tampa do tubo e digerir o pulmão por 30 minutos em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rotações por minuto a 37 graus Celsius. Pare a reação adicionando 10 mililitros de tampão BSA frio. Após a digestão, misture e dissolva os pedaços pulmonares usando uma agulha de calibre 18.
Coloque um filtro de filtro de 70 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros e transfira a mistura pulmonar digerida para o coador. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mililitros para esmagar as peças de pulmão restantes no filtro e lavá-lo com tampão BSA. Centrifugar a suspensão unicelular a 350 G por oito minutos a sete graus Celsius.
Descarte o supernatante e resuspenja as células em um mililitro de tampão de lise ACK. Misture a suspensão usando uma pipeta de um mililitro e incuba-a por 90 segundos à temperatura ambiente. Adicione 10 mililitros de tampão BSA frio à mistura de reação e centrifuse-o a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante, resuspenque a pelota no tampão de coloração e conte as células usando um hemótmetro. Resuspend as células a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro para coloração superficial. Transfira 1 milhão de células em 200 microliters por poço em uma placa de 96 poços e centrifugar a placa a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.
Prepare uma solução de bloco de citometria de fluxo diluindo anticorpos anti-1632 no tampão de coloração. Resuspense as células em 50 microliters da solução de bloco de citometria de fluxo. Incubar a suspensão por 15 a 20 minutos a quatro graus para Celsius ou no gelo.
Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de coloração à placa e centrífuga 350 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Prepare a solução de anticorpos superficiais diluindo os anticorpos superficiais no tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters da solução de anticorpos superficiais e incuba a placa a quatro graus Celsius no escuro.
Em seguida, lave as células duas vezes com tampão de coloração. Prepare o tampão de fixação e permeabilização misturando três partes de fixação e diluente de permeabilização e uma parte do tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters do buffer pré-preparado por poço da placa de 96 poços e incuba-as por 20 a 25 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Diluir o tampão de permeabilização com água deionizada purificada para preparar uma vez o tampão de permeabilização e usá-lo para lavar as células. Prepare uma solução de anticorpos intracelulares diluindo com um mililitro de tampão de permeabilização. Resuspenque as células em 50 microlitres da solução de anticorpos intracelular diluídos por poço da placa de 96 poços e incubar por 40 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Lave as células com tampão de permeabilização e, em seguida, com tampão de coloração. Após a lavagem final, resuspenja as células em 200 microliters de tampão de coloração. Adquira um mínimo de 1,5 milhão de células por amostra no citômetro de fluxo.
Após uma cirurgia bem sucedida e procedimento pós-operatório adequado, os detritos e dobras foram excluídos por meio de uma estratégia de gating. As células imunes foram identificadas utilizando o marcador CD45+hematopoiético por citometria de fluxo. As células eram distinguidas como vivas ou mortas.
As células pulmonares imunes foram categorizadas em três grupos usando anticorpos anti-GR-1 e anti-CD68. Os neutrófilos foram identificados e verificados utilizando-se Ly6G como um marcador único. A população CD45+também contém células assassinas naturais, células T e células B.
Estas células foram manchadas e verificadas por anticorpos assassinos naturais 1.1, CD3 e B220. A lavagem broncoalveolar identificou eosinófilos positivos para o marcador CD11b, e macrófagos alveolares que não expressaram altos níveis de CD11b. CÉLULAs CD45+dendríticas foram encontradas e confirmadas pela expressão CD24.
Essas células apresentaram uma resposta positiva ou negativa em relação aos marcadores CD103 e CD11b. As células negativas CD103 foram classificadas como células dendríticas convencionais e derivadas de monócitos com base na expressão CD64. as células dendríticas derivadas do monócito foram baixas positivas para o marcador dendrático CD24 e positivas para o marcador pan-macrófago CD64.
Macrófagos intersticiais com monócitos clássicos e não clássicos foram distinguidos com base na expressão CD64 e GR-1. Estas células mostraram expressão positiva para o receptor de quimioterapia CX3C um. Os passos mais importantes neste procedimento são a colheita adequada de tecidos, digestão e preparação de suspensão unicelular, e gating em células vivas e singlets.
Além de caracterizar células imunes do pulmão por citometria de fluxo, a cultura celular e ensaios funcionais podem ser realizados em populações celulares isoladas. Essa técnica pode abrir caminho para os pesquisadores explorarem novas questões em doenças do pulmão, como infecções, doenças autoimunes e câncer.
