A gripe Haemophilus é uma das principais causas de inflamação em várias doenças pulmonares crônicas, incluindo DPOC e pneumonia. Este protocolo descreve métodos para avaliar o efeito do haemophilus na inflamação pulmonar. As vantagens desta técnica é que ela permite uma avaliação abrangente das respostas imunes inatas e adaptativas.
Incubar 450 microlitros de sangue periférico com 50 microlitros de um iodeto de propídio ativado marcado com H influenzae em um tubo de cinco mililitros por 20 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Retire a amostra do banho-maria, adicione cinco microlitros de DHR e vórtice por 10 segundos. Em seguida, coloque-o de volta no banho-maria por mais 10 minutos.
Após a retirada da amostra do banho-maria, lisar os eritrócitos com cinco mililitros de solução de cloreto de amônio a 0,8% e analisar as amostras em citômetro de fluxo, conforme descrito no texto. Divida a amostra de sangue periférico em alíquotas para controle e estimulação de antígenos. Adicione anticorpos costimulatórios a ambas as amostras.
Em seguida, adicione o H influenzae não tipável à amostra de antígeno e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione o agente bloqueador de Golgi brefeldina A às amostras e incube-as por mais cinco horas. Depois de lisar os eritrócitos, como demonstrado anteriormente, fixe os leucócitos usando 500 microlitros de um a 2% de para-formaldeído por uma hora.
Conte as células usando um hemocitômetro e, em seguida, permeabilize 1 milhão de células com 100 microlitros de saponina a 0,1% por 15 minutos. Em seguida, incube as células com anticorpos fluorescentes marcados apropriados. Lave as células e, em seguida, analise-as usando um citômetro de fluxo.
Determine a proporção de células que respondem ao antígeno obtendo as populações de linfócitos relevantes. Realizar coloração de fundo em células não estimuladas para todas as citocinas a serem analisadas. Fatie cerca de 20 a 40 gramas da amostra de lobectomia em três a cinco seções de milímetros cúbicos.
Coloque-os dentro de uma câmara estéril de 50 microlitros e fragmente mecanicamente o tecido usando um desagregador apropriado. Após a desagregação tecidual, lisar os glóbulos vermelhos conforme demonstrado e ressuspender as células em RPMI estéril. Em seguida, filtre as células através de uma malha de nylon estéril de 100 micrômetros e conte as células viáveis usando o método de exclusão de azul de tripano.
Para o ensaio de infecção, ressuspenda as células pulmonares em RPMI para uma concentração final de 4 milhões de células por mililitro por tubo. Em seguida, infecte as células a um MOI de 100 bactérias por célula. Solte a tampa meia rotação para permitir a transferência de gás nos tubos.
Coloque as células no rotador do tubo e incube-as a 37 graus Celsius enquanto gira a 12 RPM. Uma hora após a estimulação, adicionar grefeldina A para evitar a exportação extracelular de citocinas e incubar as suspensões celulares por mais 16 a 22 horas com rotação. No dia seguinte, lavar a suspensão celular com 500 microlitros de PBS contendo 1% de albumina sérica bovina e 0,01% de azida sódica.
Em seguida, core a suspensão celular para marcadores específicos da superfície celular de linfócitos humanos por uma hora. Em seguida, lave as células com PBS e fixe-as e permeabilize-as, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, incube as células com anticorpos de coloração de citocinas intracelulares por uma hora.
Em seguida, lave as células e ressuspeite-as em 100 microlitros de PBS antes da aquisição de dados em um citômetro de fluxo. Meça a proteólise através da ação de metaloproteinases, adicione substrato de gelatina marcado com fluoresceína diretamente nas lâminas de seção do tecido pulmonar. Coloque as lâminas horizontalmente e incube-as em uma câmara umidificada protegida à luz a 37 graus Celsius por uma hora.
Para preparar controles negativos, adicione um tampão de reação x sem gelatina fluorescente às seções para análise posterior. Células mononucleares do sangue periférico foram fechadas usando espalhadas para frente e para o lado para definir a população de fagocitos. A população de fagocitos foi ainda definida pela expressão de CD14 para rotular os monócitos.
A medição das EROs foi realizada via oxidação de DHR 123 para produzir fluorescência. A mediana de fluorescência da amostra estimulada foi comparada com a do controle. A produção intracelular de citocinas pelos linfócitos foi medida por citometria de fluxo.
As células foram analisadas primeiro quanto à expressão do marcador leucocitário CD45 e, em seguida, para o CD três e CD quatro, CD oito. As células CD três, CD quatro positivas foram avaliadas quanto à produção intracelular de citocinas em amostras controle e estimuladas. A atividade da protease foi medida por zimografia NC dois em cortes de tecido pulmonar não fixos.
A coloração fluorescente indicou a presença de atividade da MMP, que também foi co-localizada com a expressão da cromatina. A adição de anticorpos às amostras de tecido pulmonar requer concentração e a coloração das células exigirá otimização em experimentos preliminares. O sobrenadante das amostras de tecido pulmonar pode ser analisado para outros mediadores inflamatórios usando técnicas como ELISA e Essas técnicas podem ser usadas para avaliar o efeito de possíveis terapias na inflamação pulmonar.
