Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: P01CA040035 (FE / JAS) e Prêmio de Desenvolvimento VA Carreira (JAS).

1. Manutenção de células <ol><li> Subclones osso muitos metastáticos de 231-MDA-MB existem que têm propensão variável para a colonização e crescimento ósseo. Para os nossos ensaios, usamos um clone derivado da GFP-tagged MDA-MB-231 desenvolvido no UTHSCA 2. Este em particular do sub-clone irá formar visíveis lesões ósseas osteolíticas em cerca de 3 semanas após a inoculação, com sacrifício de 4 semanas. </li><li> Manter as células em DMEM contendo 10% de FBS e 0,1 mg / ml de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em 5-8% de CO 2 7. </li><li> Células de passagem na confluência de 80-90% e re-placa, a uma diluição 1:10 (isto varia dependendo do tipo de célula e da placa de tamanho. Por MDA-MB-231 células de uma T-75 é de aproximadamente 6x10 5), os quais é de aproximadamente 72 h cada. </li><li> MDA-MB-231 células de manter uma aparência geralmente fibroblástica com pseudopodia numerosos. Qualquer arredondamento é indicativo de aglomeração ou de outra tensão indesejável e deve ser evitado uma vez que estapode afetar o potencial metastático in vivo. </li><li> Idealmente, as células devem ser mantidas em cultura apenas brevemente antes da inoculação (recomendamos menos de uma semana ou até que tenha células suficientes para a experiência), e um novo frasco deve ser descongelado se o arredondamento ou alterações na taxa de crescimento celular ocorre. </li></ol> 2. Preparação de células <ol><li> Tripsinizar as células em confluência de 80-90% com 0,15% de tripsina / EDTA (Gibco diluir 0,5% de tripsina EDTA 1:2 em PBS). Esta concentração permite desprendimento rápido (&lt;2 min) e reduz a aglomeração das células. </li><li> Imediatamente remover as células da placa com 10 ml de gelo-frio DMEM contendo 10% de FBS, pipeta no tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender o granulado em um tubo cónico de 50 ml em 25 ml de PBS gelado (sem Ca e Mg) e contar. </li><li> Centrifugar novamente a pelota, e ressuspender em 10 6 células por ml (intracardíaca) ou menos 250.000 células/10 ul (intratibial) em PBS gelado. A têmperatura de PBS é importante para prevenir a aglutinação de células e embolia subsequente após a injecção. A suspensão de células devem permanecer em gelo durante a execução de injecções e serão viáveis ​​e permanecem não-agregada, durante 30 min. Embora o número exato de placas necessárias variam de investigador para investigador, geralmente usamos uma T-75 para entre 8-10 ratos. </li></ol> 3. A inoculação intracardíaca <ol><li> 4-6 semanas de idade do sexo feminino (Foxn nu-/ -: Harlan) os ratos são usados ​​para estas experiências, embora outros ratinhos imunocomprometidos (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, e etc) podem também ser utilizado em experiências de células cancerosas humanas. </li><li> Os ratos sem pêlo devem ser alimentados com dieta 2920x Teklad dias 5-10 antes da injecção para diminuir a mortalidade a partir do procedimento de injecção, e reduzir a fluorescência de fundo nos procedimentos de imagiologia (uma vez que o alimento é alfafa livre). </li><li> Se usar outros ratos do que nu / nu, depilação, barba ou usando Nair (no nosso Nair experiência funciona melhor) no ar ventral abdominaleA antes de iniciar procedimento. </li><li> Anestesiar mouse em uma câmara de isolamento usando um vaporizador isoflurano (2,5% Iso: 2-3 L / min O 2) ou anestesia preferido outro (em nossa experiência isoflurano é o melhor tolerada para as inoculações intracardíacos). </li><li> Mover um rato de cada vez para o cone do nariz da máquina de anestesia dentro de uma capa de aço inoxidável ventilado. </li><li> Posicione cada rato em suas costas com o peito virado para cima. </li><li> Lava-se a caixa com uma zaragatoa de 10% de povidona / iodo / solução seguido de etanol a 70%, repetindo duas vezes. </li><li> Peito Mark rato por injecção (através de um marcador estéril ou marcação ligeiramente para o lado para manter o local da injecção estéril). Nós usamos um meio do caminho entre o local marca fúrcula e superior do processo xifóide, e um pouco para a esquerda (anatômica) do esterno. Desenhar uma pequena bolha de ar para dentro da seringa para criar espaço entre o êmbolo e o menisco (importante para ver pulsação cardíaca) de 300 ul de 28 g ½ seringa de insulina, eelaborar 100 ul de células. </li><li> Mantenha a agulha na posição vertical. Enquanto mantém a pele do rato tenso com a outra mão, inserir a agulha. </li><li> Inserção bem sucedida no ventrículo cardíaco esquerdo deve resultar em um impulso luminoso vermelho distinto de sangue na seringa. Nessa profundidade, cuidadosamente deprimir êmbolo da seringa (100 ul de volume), sem movimento significativo da agulha para evitar a perfuração do coração ou células que derramam na cavidade torácica. </li><li> Depois as células são injectadas, puxe ligeiramente o êmbolo para criar uma pequena quantidade de pressão negativa para reduzir o gotejamento de células para dentro da cavidade torácica. </li><li> Puxar a agulha directamente do tórax, enquanto tendo a certeza de evitar a inclinação da agulha durante a remoção, que pode rasgar o revestimento do coração e provocar sangramento. </li><li> Aplique uma leve pressão no peito o local de injecção para reduzir o sangramento. </li><li> Remover do rato a partir do cone de nariz e continuar a aplicar uma ligeira pressão durante cerca de 1 min. </li><li> Mova o mouse para almofada de aquecimento até que esteja totalmente conconsciente. </li><li> Se o mouse começa a girar ou contorcer após a recuperação, a causa provável é uma embolia. Injectar rato intraperitonealmente com 80-120 mg / kg de cetamina a aumentar o fluxo de sangue e o débito cardíaco, enquanto diminui a resistência vascular. Isso deve ajudar a passar o mouse o coágulo. Depois de isto ocorrer, o melhor é mudar preparações de células, uma vez que indica que as células estão a aglutinação. Mudamos preparações de células após cerca de 8 ratinhos, ou 30 min. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Injectar rato com Buprenex (0,1 mg / kg) ou analgésica semelhante aprovado imediatamente antes do procedimento. </li><li> Anestesiar mouse usando isoflurano, em seguida, passar para cone do nariz e manter a anestesia. </li><li> Limpar ambas as pernas com 10% de povidona / iodo zaragatoa / solução, seguida por etanol, repetindo duas vezes. Depilar as pernas (com Nair ou produto similar) antes da limpeza de pele se presente. </li><li> Gentilmente segure maléolo lateral, maléolo medial, e na metade inferior da tíbia com o indicador e thumb, em seguida, a perna curva (combinação de flexão e rotação lateral, de tal modo que o joelho é visível e acessível. </li><li> Humedecer a pele com EtOH a 70% para aumentar a visibilidade do ligamento patelar subjacente, que deve ser visível como uma distinta, linha branca e espessa. Enquanto segurando firmemente tornozelo / pé de inserção do mouse 28g ½ agulha sob patela, no meio do ligamento patelar, e na área intercondilar anterior em cima de tíbia. </li><li> Ao inserir a agulha na tíbia, guiar com cuidado através da placa de crescimento usando a pressão constante, firme, com ação de perfuração leve. </li><li> Após a penetração da placa de crescimento da tíbia, a agulha irá encontrar resistência marcadamente menos. </li><li> Usar um movimento suave e lateral da agulha para assegurar a agulha se encontra na tíbia e através da placa de crescimento. Movimento será limitado se agulha está no lugar certo dentro de tíbia. </li><li> Lentamente deprimir o êmbolo para injectar 10 jil de solução de células. Pouca ou nenhuma resistência deve ser sentida neste ponto. </li><li> Slowly extrair agulha. </li><li> Seguindo o mesmo procedimento, proceder à próxima etapa de injectar 10 jil de PBS. </li><li> Retire do mouse de anestesia e continuar a almofada de aquecimento até a recuperação. </li><li> Monitorar os ratos sobre o hr 24 próximo e injetar com Buprenex adicional a cada hora 12 se os animais continuam a mostrar sinais de sofrimento. </li></ol> 5. Imagem no Tempo <ol><li> Imagem de luciferase: Onde imaging, aplicável luciferase deve ser utilizada a partir de 7 dias pós-inoculação de células de tumor (embora na maioria dos modelos de metástases ósseas, detectável mais próximo de 14 dias). Rato é injectado por via intraperitoneal com 150 mg / kg de luciferina, anestesiados, e fotografada 8 min após a injecção utilizando equipamento IVIS 8. </li><li> GFP imagem: Normalmente GFP-expressando os tumores começam a ser detectáveis ​​por volta do dia 10-14 para 16-21 injeções intratibial e para experimentos intracardíacos usando Maestro equipamentos de imagem (CRI) 9. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano (3%) E mantidos sob anestesia através de um cone de nariz na câmara de imagem Maestro. Para os nossos eGFP expressam células que usam o conjunto de filtro azul (498 excitation/515 emissão para eGFP) a 500 ms exposição em passos de 10 nm. </li><li> Faxitron (X-ray): Raios-X são tomadas semanalmente a partir entre os dias 7 a 14. Lesões serão visíveis no modelo intracardíaca no dia 21 e uma semana antes da injecção intratibial 3. Nossos dados radiográficos em ex vivo e in vivo foram adquiridos utilizando um Faxitron LX-60 a 35 kV, durante 8 segundos de exposição. </li><li> Imagem Outros: modalidades de imagem será inteiramente baseada na investigação específica. Além dos métodos acima descritos, a imagem com base no animal vivo 3D micro-tomografia computadorizada (μCT), micro-positron tomografia de emissão (μPET), e outras modalidades 10,11 pode fornecer informação valiosa. </li></ol> 6. Sacrifício do mouse <ol><li> Cada modelo tem um curso de tempo ligeiramente diferente. Com MDA-MB-231 ratos células geralmente tornam-se caquéticos ou paraplégico entre 21 e 35 dias e geralmente em torno de 28 dias (TI injetaram em ratos entre 21-28 dias). </li><li> Uma vez que vários ratos desenvolvem lesões que começam a romper o osso cortical, tornar-se paraplégico, ou perder entre 10-20% do peso corporal, sacrificar todos os camundongos no estudo usando cetamina / xilazina overdose com luxação cervical (ou método IACUC outro aprovado). </li><li> Retirar os ossos necessários para posterior estudo e armazenar em formalina a 4% tamponada. </li><li> Camundongos com tumores no peito são um sinal de uma injeção de falta e devem ser excluídos do estudo. </li></ol> 7. Análise Ex Vivo <ol><li> μCT: digitalização em EtOH 70% permite parâmetros estruturais e histológicas a ser medido na amostra mesmo osso. </li><li> Contorno e analisar de acordo com o delineamento experimental individual e equipamento disponível 10. Nossos dados foi obtida com um μCT Scanco 40 usando 12 uM resolução. </li><li> Histomorphometry: espécimes processo usando preferenciais métodos histológicos e manchar com Hematoxilina / Eosina 7 </li></ol> 8. Resultados representativos Após inoculação intracardíaca ou intratibial de células tumorais (Figura 1) os ratinhos foram monitorizados semanalmente por radiografia e fluorescência (ou luminescência). Lesões normalmente tornar-se aparente por raios-X entre 2 e 3 semanas, enquanto que eles podem ser visíveis por fluorescência e luminescência logo na semana 2, dependendo do modelo (Figura 2). As lesões são visíveis como buracos escuros no osso, e tornar-se mais pronunciada com o tempo (Figura 3). As lesões foram quantificados utilizando Metamorph análise de radiografias e fluorescência foi quantificada através de Maestro aquisição de imagem (CRI) e software de análise. Como as lesões começam a crescer, freqüentemente se tornam ratos caquéticos. Sacrifício é necessária quando os ratos perderam entre 10-20% do seu peso corporal inicial. A condição do<html> ratos podem alterar-se rapidamente e deve ser monitorada várias vezes durante o dia. Entre as semanas 3-4 ratos começaram a arrastar uma ou ambas as patas traseiras e todo o estudo foi sacrificado. Imagens foram tiradas antes do sacrifício. Após overdose de anestesia, foi coletado sangue para medir marcadores de remodelação óssea, ou outros fatores. Após deslocamento cervical, a pele foi separada do rato e os ossos excisados ​​e limpos para imagiologia ex vivo (Figura 3), que irá permitir a visualização de focos de tumor, pelo menos, 7 dias mais cedo do que nas técnicas de imagem in vivo. Uma vez que os ossos da imagem foram preenchidos foram colocados em cassetes rotulados e armazenados em formalina para fixação e processamento adicional ou análise histológica μCT. Histomorfometria foi realizada nas amostras para indicar a carga do tumor e BV / TV após μCT foi realizada em uma tíbia para quantificar a quantidade de destruição óssea (Figura 4). / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. A colocação apropriada de injecção. Vista radiográfico Ventral (A) do tórax do rato adulto mostrando a colocação apropriada da agulha no 4 º espaço intercostal e para dentro do ventrículo esquerdo para a inoculação intracardíaca. Marcos anatômicos são mostrados com linhas tracejadas horizontais sobre o esterno (destacado em branco). Na pele do rato do manúbrio e processo xifóide servir como pontos de referência, e que a agulha é inserida ligeiramente à esquerda do esterno. Vista radiográfico ventral (B) da perna do rato adulto mostrando a colocação apropriada da agulha na tíbia proximal, alinhados entre os côndilos. A partir de uma perspectiva lateral, a ponta da agulha é colocada atrás da tuberosidade tibial e profunda para a placa epifisária. Localização ideal para a injeção é mostrado pelo círculo branco. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Figura 2. Curso de tempo de modelos de metástases ósseas. Progressão de cancer induzida por doença óssea mostrado com raios-x e GFP + imagens fluorescentes dos tumores in vivo a partir de intratibial injecções (A) e as injecções intracardíacas (B). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Figura 3. Curso de tempo da intracardíaca MDA-MB-231 modelo Fileira superior:. Imagem ex vivo mostrando fluorescência GFP no dia 0, 14, 21, e 28 após a injecção intracardíaca de 231-MDA-MB. Note-se que os focos de tumor no dia 14 só são visíveis em ex vivo após a remoção do tecido mole. Na fila de baixo: imagens radiográficas ex vivo dos fêmures mesmos ilustram lesões ósseas osteolíticas. Note-se que a destruição do osso não é normalmente visível até 3 semanas após a injecção cardíaca. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificação do osso metastático progressão GFP. Tumor + como visualizado por Maestro imagiologia ex vivo de tibiae de um rato rolamento não-tumor (A) e de um ratinho de 4 semanas após a injecção intracardíaca de uma GFP expressando MDA-MB-231 subclone (B). Focos tumorais correlacionam-se com as áreas de destruição óssea, como mostrado por Faxitron (D) em relação um osso sem tumor (C). Dados estruturais e osso mineral a partir de medições microCT é processado como imagens 3D de um osso saudável (E) e um rolamento de osso tumor (F) em que as áreas de destruição óssea, são mostrados como espaço vazio. Detalhe do osso e tumores ainda é observada em correspondentes H &amp; E manchados cortes histológicos (G &amp; H).

<ol>
	<li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis:+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior.">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li><li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer.">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li><li>Johnson, R. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Estudos de induzida por tumor, doença óssea dependem de vários modelos animais dos quais os dois mais utilizados são inoculações intracardíacos e intratibial. Em muitos casos, intracardíaca é a melhor opção para estudar a metástase óssea, no entanto, não representa o processo completo metastático, e, portanto, almofada de gordura mamária ou outras injecções ortotópicos devem, idealmente, ser utilizada para esse fim. As células tumorais não metastatizam prontamente a partir do sítio primário, na ma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 células de cancro da mama humano </td><td> Originalmente ATCC-Internamente clonado e selecionado </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech Inc </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas Biológica </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Maestro </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT do scanner </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Ratinhos nus atímicos </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> As seringas de insulina (300 ul, 28,5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Compasso de calibre </td><td></td></tr><tr><td> Dieta Roedor irradiado </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

As metástases ósseas são uma ocorrência comum em determinadas neoplasias, incluindo da mama, da próstata e do pulmão. Uma vez estabelecido no osso, os tumores são responsáveis ​​por significativa morbidade e mortalidade 1. Assim, existe uma necessidade significativa para compreender os mecanismos moleculares que controlam o estabelecimento, crescimento e actividade de tumores no osso. Vários modelos in vivo foram criados para estudar esses eventos e cada um tem vantagens e limitações específicas. O modelo mais comumente utilizado utiliza inoculação intracardíaca de células tumorais diretamente para o fornecimento de sangue arterial do atímicos (nude) ratos BalbC. Este procedimento pode ser aplicado a muitos tipos diferentes de tumores (incluindo o cancro da próstata PC-3, carcinoma de pulmão, e tumores mamários de rato almofada de gordura), no entanto, neste manuscrito iremos focar sobre o modelo de cancro da mama, MDA-MB-231. Neste modelo utilizamos um clone altamente osso seletivo, derivado originalmente no grupo do Dr. Mundy, em San Antonio 2, que hcomo já foi transfectadas para a expressão da GFP e re-clonados por nosso grupo 3. Este clone é uma variante óssea metastática com uma elevada taxa de metástases osteotropism e muito pouco para o fígado, pulmão, glândulas supra-renais ou. Enquanto injeções intracardíacas são mais comumente usados ​​para estudos de metástase óssea 2, em certos casos intratibial 4 ou mamária injeções de gordura abdominal são mais adequadas. Injecções intracardíacas são tipicamente realizadas ao usar células tumorais humanas com o objectivo de monitorizar as fases posteriores de metástase, especialmente a capacidade de células cancerígenas para prender no osso, sobreviver, proliferam, e estabelecer os tumores que se desenvolvem em cancro induzido por doença óssea. Intratibial injecções são realizadas se aborda a relação de células cancerosas e de ossos depois de um tumor tenha metastizado para o osso, o que se correlaciona aproximadamente com a doença óssea metastática estabelecida. Nenhum desses modelos recapitula os primeiros passos no processo de metástase antes de embolia e entradade células de tumor para a circulação. Se monitorizar o crescimento do tumor primário ou metástase de um local primário para o osso, em seguida mamárias inoculações almofada de gordura são geralmente preferido, no entanto, muito poucas linhas de células tumorais, de forma consistente metastizar para o osso a partir do sítio primário, com 4T1 osso preferenciais clones, um rato mamária carcinoma, sendo a excepção 5,6. Detalhes Este manuscrito de inoculação procedimentos e etapas principais destaques em análises após a inoculação. Especificamente, ele inclui a cultura de células, os procedimentos de inoculação de células tumorais para inoculações intracardíacos e intratibial, bem como uma breve informação sobre a monitorização semanal por raio-x, de fluorescência e análise histomorfométrica.

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Models of Bone Metastasis

Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

Modelos de metástase óssea

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Research

JoVE Journal

Medicine

41.9K visualizações.  Vanderbilt University. Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Ensaio Metástase Experimental

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medicina

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

A rigidez ajustável, Fixador Externo para os Rat Femur Osteotomia e segmentar defeito ósseo Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

De alta frequência Ecografia de mouse linfonodos cervicais

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...