Este método qRT-PCR pode abordar questões relacionadas ao perfil de expressão microRNA no soro de camundongos em condições como comprometimento renal dependente da idade. A técnica permite a detecção de expressão de microRNA com alta precisão e sensibilidade por um processo simples que economiza tempo e previne erros técnicos. Para começar, inciso a pele do abdômen usando pinças e tesouras cirúrgicas.
Corte os músculos da membrana peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas. Levante a membrana peritoneal usando pinças e faça uma incisão lateral na borda superior com uma tesoura cirúrgica. Continue a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas.
Identifique a veia cava inferior usando dois cotonetes de algodão umedecidos pbs. Insira uma agulha de 30 G presa a uma seringa de 1 mililitro na cava vena inferior e puxe a seringa. Puxe lentamente a agulha para fora para evitar hemólise.
Transfira o sangue para um tubo de spitz de 1 mililitro com heparina, e misture invertendo. Centrifugar o tubo de spitz por 10 minutos a 3000 vezes G à temperatura ambiente. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro fresco.
Pegue 200 microliters de amostra de soro e adicione 1.000 microliters de reagente de lise à base de fenol/guanidina. Vórtice a mistura por 5 segundos, e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione 200 microliters de clorofórmio, e misture invertendo o tubo 15 vezes.
Incubar a amostra à temperatura ambiente por 3 minutos, seguida de centrifugação. Sem perturbar a pelota, transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mililitro. Adicione 450 microliters de 100% etanol, e vórtice do tubo por 5 segundos.
Em seguida, carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de spin ancorada em membrana, e centrífuga-a. Descarte o fluxo-through e adicione 700 microliters de Wash Buffer 1 fornecidos no kit. Centrifugar novamente, e descartar o fluxo através.
Repita a lavagem com 500 microliters de Wash Buffer 2 para remover os sais de rastreamento. Adicione 500 microliters de 80% de etanol, centrífuga e descarte o fluxo do tubo de coleta. Centrifugar novamente a coluna de giro e transferir a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro.
Em seguida, adicione 14 microliters de água sem RNase e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Gire a coluna novamente por 1 minuto a 15000 vezes G à temperatura ambiente. Prepare uma solução de mixagem mestre e adicione 8 microliters por poço em um tubo de tira de 8 poços.
Adicione 12 microliters do RNA total extraído em cada tubo, e centrifugar o tubo por 15 segundos a 2000 vezes G à temperatura ambiente. Coloque o tubo em um cicloviário térmico e inicie a incubação para sintetizar o cDNA. Após a incubação, transfira o cDNA para um tubo de microcentrifuuge fresco.
Diluir o cDNA dez vezes com água destilada. Em seguida, vórtice, seguido de centrifugação por 5 segundos a 2000 vezes G à temperatura ambiente. Em um tubo de microcentrifuge, prepare a solução de mix mestre conforme descrito no protocolo de texto e o vórtice da solução.
Adicione 22,5 alíquotas de microliter em cada poço de uma placa de 96 poços, seguido por 2,5 microliters de cDNA. Sele a placa usando uma película adesiva e centrifufique a placa por 30 segundos a 1000 vezes G.Coloque a placa no sistema PCR em tempo real. Modifique as configurações fornecendo um nome para o experimento.
Em seguida, selecione 96-well 0.2 mililitros como o tipo de experimento, ct comparativo como o método de quantitação, padrão como o modo de execução do sistema, e reagentes SYBR Green como os reagentes para detectar a sequência de destino. Forneça nomes para a amostra e o miRNA alvo em cada poço. Atribua amostras duplicadas, escolha uma amostra de referência e controle endógeno e selecione nenhuma para o corante usar como referência passiva.
Para eliminar a contaminação cruzada do reagente, configure transcriptase reversa negativa e um controle não-modelo para expressão miRNA. Em seguida, certifique-se de que o volume de reação é definido para 20 microliters, e as condições de ciclismo PCR são definidas em 95 graus Celsius por 15 minutos, em seguida, 40 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, resmando a 55 graus Celsius por 30 segundos, e extensão a 70 graus Celsius por 30 segundos. Após a conclusão do processo, clique em analisar para analisar os dados do qRT-PCR.
Confirme se a linha de limiar automaticamente selecionada pelo programa é apropriada para cada poço. Verifique o valor do ciclo limiar do controle endógeno e os miRNAs de destino analisados em cada amostra. Determine os valores ct pela intersecção da curva de amplificação e linha limiar.
os dados do miRNA qRT-PCR para o modelo de comprometimento renal dependente da idade mostraram que, em comparação com os camundongos de controle SAMR1, o nível renal de miRNA-7219-5p aumentou significativamente em camundongos experimentais SAMP1, enquanto o nível renal de miRNA-7218-5p diminuiu. Os níveis de expressão do miRNA-223-3p não mudaram em nenhuma das cepas. Os níveis de soro tanto de miRNA-7219-5p quanto de miRNA-7218-5p foram consideravelmente aumentados nos camundongos SAMP1, enquanto os níveis de miRNA-223-3p foram inalterados.
Você deve inserir a agulha na veia cava inferior e extrair sangue sem penetrar no vaso. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no perfil de expressão microRNA no soro de camundongos para uma ampla gama de condições patológicas.
